Fusion vésiculaire : protéines SNARE
Régulation des protéines SNARE
Synaptotagmines : structure

Sommaire

La structure des synaptotagmines (Syt) contient deux domaines C2 capteurs de Ca⁺⁺.

Structure des synaptotagmines

Structure générale

Insertion de de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Nyenhuis et coll )

La structure de la synaptotagmine-1 (Syt1) comprend :

un domaine transmembranaire N-terminal (1-58), qui lie Syt à la vésicule synaptique,
un lien (linker) juxtamembranaire (80-139),
Domaines C2 de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Xue et coll)

deux domaines C2 cytoplasmiques C-terminaux en tandem, appelés C2A (140-254) et C2B, (272-479), homologues à ceux de la protéine kinase C (PKC), séparés par un domaine de liaison flexible à 9 résidus.

Domaines C2

Les domaines C2, composés d'un sandwich β anti-parallèle à huit brins conservés d'environ 130 résidus avec des boucles flexibles émergeant du haut et du bas, confèrent des propriétés distinctes dépendantes et indépendantes du Ca⁺⁺ (C2-domain containing calcium sensors in neuroendocrine secretion 2016).

Ces domaines interagissent avec la membrane et la pénètrent.

C2B est le domaine fonctionnel principal de la synaptotagmine.

La mutation d'un résidu de la pointe hydrophobe de la boucle 3 de C2B, i.e. l'isoleucine (I420) de Syt1, qui pénètre dans les membranes chargées négativement, est mortelle pour l'embryon et provoque une diminution de la libération évoquée plus sévère que celle observée chez les mutants null de la Syt.

Poches ou boucles de liaison au Ca⁺⁺

Deux boucles distinctes au sommet de chaque domaine C2, appelées boucle 1 et boucle 3, forment une poche de liaison Ca⁺⁺contenant respectivement 3 et 2 résidus aspartate (D) chargés négativement (Three-Dimensional Structure of the Synaptotagmin 1 C2B-Domain: Synaptotagmin 1 as a Phospholipid Binding Machine 2001 et How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release? 2008 et Signaling through C2 domains: More than one lipid target 2014).

1. Le domaine C2A de Syt1 lie trois Ca⁺⁺ via cinq résidus aspartate (D172, D178, D230, D232, D238) et un résidu sérine (S235).

Site de liaison au Ca++ de C2A de Syt1 et Syt7 — Site de liaison au Ca⁺⁺ de C2A de Syt1 et Syt7
(Figure : vetopsy.fr d'après Fernandez et coll et Voletti et coll)

2. Le domaine C2B lie deux Ca⁺⁺ via cinq résidus aspartate (D303, D309, D363, D365, D371) (Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate drives Ca2+-independent membrane penetration by the tandem C2 domain proteins synaptotagmin-1 and Doc2βCa2+-independent membrane penetration by syt1 and Doc2βA 2019).

Site de liaison au Ca++ de C2B de Syt1 — Site de liaison au Ca⁺⁺ de C2B de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Fernandez et coll)

3. Dans C2A et C2B, la coordination des Ca⁺⁺ est incomplète et les phospholipides membranaires doivent compléter la sphère de coordination du Ca⁺⁺ (Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Increases Ca2+ Affinity of Synaptotagmin-1 by 40-fold 2012).

L'affinité de Syt1 pour le calcium est en effet fortement renforcée par la présence les lipides anioniques comme la phosphatidylsérine (PS) et PI(4,5)P2 ou PIP2.
Résidus hydrophobes ancrés dans la membrane
(Figure : vetopsy.fr)

La liaison Ca⁺⁺ neutralise efficacement la répulsion électrostatique entre la membrane cible et la poche de liaison calcique, permettant aux résidus non polaires situés à l'extrémité de chaque boucle de calcium de s'insérer dans la membrane (Ca2+-Triggered Simultaneous Membrane Penetration of the Tandem C2-Domains of Synaptotagmin I 2006).

4. Deux résidus hydrophobes hautement conservés sont localisés aux extrémités de chaque poche :

un dans la boucle 1, adjacent au premier résidu d'aspartate, M173 dans C2A et V304 dans C2B,
un dans la boucle 3, i.e. F234 dans C2A et I367 dans C2B, entre les 4^ème et 5^ème résidus d'aspartate (Crystal Structure of the Cytosolic C2A-C2B Domains of Synaptotagmin III: Implications for Ca2+ -independent SNARE Complex Interaction 1999).

Ces résidus sont partiellement insérés dans le feuillet interne de la membrane plasmique (10 Å de profondeur) et peuvent induire une déformation locale de la membrane plasmique (How Synaptotagmin Promotes Membrane Fusion 2007).

Différences entre C2A et C2B

Hélice HB de C2B de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Wu et Schulten)

Hélices de C2B

1. La région C-terminale de C2B, contrairement à C2A, contient deux hélices.

a. L'hélice HA interagit avec la complexine ( interface tripartite).

b. L'hélice HB, i.e. ⁴⁰⁹VEEEVDAMLAVKK⁴²¹, peut générer une courbure de la membrane lors de la liaison à Ca⁺⁺ car elle contient :

de nombreux résidus de lysine hydrophobes et positifs qui peuvent interagir avec la membrane chargée négativement,
des résidus négatifs proches de la boucle Ca⁺⁺.

Patch polybasique de C2B

C2B possède une face polybasique hautement chargée qui permet au domaine de s'associer également de manière indépendante du Ca2+ aux interfaces membranaires chargées négativement (The Calcium-Dependent and Calcium-Independent Membrane Binding of Synaptotagmin 1: Two Modes of C2B Binding 2010).

2. Un tronçon de quatre résidus de lysine consécutifs (K324-K327) forme un patch polybasique ou polylysine, i.e. ³²¹KRLKKKKTTIKK³³², situé sur le côté du domaine C2B (C2B Polylysine Motif of Synaptotagmin Facilitates a Ca2+-independent Stage of Synaptic Vesicle Priming In Vivo 2006 et Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles 2012).

Domaine C2B de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Nyenhuis et coll )

Ce domaine favorise l'amorçage et l'amarrage des vésicules synaptiques en absence de Ca⁺⁺ en entrant en interaction avec :

PI(4,5)P2 ou PIP2 fortement (Phosphatidylinositol 4,5 Bisphosphate Controls the cis and trans Interactions of Synaptotagmin 1 2019),
la phosphatidylsérine (PS) de manière beaucoup plus faible (PtdInsP2 and PtdSer cooperate to trap synaptotagmin-1 to the plasma membrane in the presence of calcium 2016),

Lors d'expériences sur les granules sécérétoires purifiés, l''élimination de PIP2 réduit leur liaison à la membrane, l'efficacité de la fusion, ralentit le moment de la fusion ou le mode de libération, modifie la conformation SNARE et réduit la cinétique de fusion.

L'élimianation de PIP2 produit également l'ouverture du pore de fusion similaire à celui des mutants RQ et RQRQ

3. En présence de Ca⁺⁺, les boucles de liaison au Ca⁺⁺ et la face polybasique fonctionnent en coopération pour conduire l'association membranaire du domaine C2B.

Apex d'arginine

L'apex d'arginine est une région de C2B localisée à la face opposée aux boucles de liaison au Ca⁺⁺ (Conserved arginine residues in synaptotagmin 1 regulate fusion pore expansion through membrane contact 2021).

1. Une paire d'arginine (R398 et R399), ainsi que le patch polybasique seraient essentiel dans la fusion vésiculaire.

Contacts membranaires de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Nyenhuis et coll )

Cet apex est supposé permettre au domaine C2B de faire le pont entre les bicouches (The Janus-Faced Nature of the C2B Domain Is Fundamental for Synaptotagmin-1 Function 2008).
Cet apex d'arginine s'associe aux bicouches lipidiques et qu'il pourrait faciliter le contact du domaine C2B avec les deux bicouches opposées (Solution and Membrane-Bound Conformations of the Tandem C2A and C2B Domains of Synaptotagmin 1: Evidence for Bilayer Bridging 2010).

Remarque : La mutation RQ déplace l'apex vers la phase aqueuse de ~5 Å, la double mutation RQRQ élimine l'interaction membranaire

Le domaine C2B établit un contact membranaire simultané au niveau de l'apex d'arginine, de la face polybasique et des boucles de liaison au Ca⁺⁺, ce qui serait possible qu'avec une surface courbe (Computational Lipidomics of the Neuronal Plasma Membrane 2017).

La liaison membranaire des domaine C2 est nécessaire pour initier la fusion, mais les interactions membranaires créées par l'apex d'arginine sont nécessaires pour en déterminer le bon moment et l'ouverture rapide du pore de fusion.

Interactions apex arginine/SNARE
(Figure : vetopsy.fr d'après Nyenhuis et coll )

2. L'apex s'associe également aux SNARE par T285, F349 et E350, ce qui est un peu différent du modèle tripartite ( loupe région II de l'interface primaire).

Remarque 1 : la mutation RQ déplace l'apex vers la phase aqueuse de ~5 Å, la double mutation RQRQ élimine l'interaction membranaire.

Syt7 démontre un mode de libération qui est significativement différent de Syt1, i.e. le moment de l'événement de fusion semble être ralenti. Une comparaison de la séquence de l'apex d'arginine entre Syt1 et Syt7 montre que Syt7 est RQ plutôt que RR (Synaptotagmin-7 enhances calcium-sensing of chromaffin cell granules and slows discharge of granule cargos 2020).

Remarque 2 : l'interaction faite de l'apex d'arginine avec les SNARE est éliminée lorsque PI(4,5)P2 ou PIP2 est présent dans la membrane.

Rôles de C2A

C2A joue un rôle important en tant que facilitateur de la liaison C2B (Synaptotagmin-1 membrane binding is driven by the C2B domain and assisted cooperatively by the C2A domain 2020 et The C2A domain of synaptotagmin is an essential component of the calcium sensor for synaptic transmission 2020).

La mutation du résidu analogue dans le domaine C2A, i.e. la phénylalanine (F286), n'a pas d'impact sur la viabilité et n'a inhibé la libération de neurotransmetteurs que de 50 % (Membrane Penetration by Synaptotagmin Is Required for Coupling Calcium Binding to Vesicle Fusion In Vivo 2011).

Toutefois, la mutation simultanée des sites de la boucle 1 et de la boucle 3 de C2A a entraîné une abolition presque complète de la libération évoquée, i.e. plus sévère que celle observée chez les mutants null de la Syt.

Modèle de liaison de la vésicule synaptiqueà la membrane présynaptique — Modèle de liaison de la vésicule synaptique à la membrane présynaptique
(Figure : vetopsy.fr d'après Lin et coll )

Le domaine C2A serait un composant essentiel pour traduire la fonction de commutation électrostatique de la synaptotagmine en fusion de la vésicule avec la membrane présynaptique. Les deux domaines coopèrent pour positionner Syt1 dans la configuration la plus favorable pour une énergie de liaison maximisée.

Domaine juxtamembranaire

1. Le domaine de liaison juxtamembranaire est important pour la fonction de Syt1 (The synaptotagmin 1 linker may function as an electrostatic zipper that opens for docking but closes for fusion pore opening 2015 et Transmembrane tethering of synaptotagmin to synaptic vesicles controls multiple modes of neurotransmitter release 2015).

L'attachement transmembranaire aux vésicules synaptiques par le maintien de la longueur du linker juxtamembranaire et l'orientation du domaine C2 sont essentiels pour que Syt1 régule la neurotransmission.
Cette attache vésiculaire permet aux domaines C2A-C2B de Syt1 de réguler plusieurs modes de libération de neurotransmetteurs, i. e. voie synchrone ou une voie asynchrone.

Lien (linker) de la synaptotagmine-1 — Lien (linker) de Syt1
(Figure : vetopsy.fr d'après Lai et coll )

2. Les différences de charges dans le lien rapproche aussi la vésicule synaptique de la membrane ( figure du modèle de liaison membranaire).

Interactions des synaptotagmines

Biologie cellulaire et moléculaireConstituants de la celluleTransport membranaireTransports sans mouvements membranairesTransports passifsTransports actifsTransports avec mouvements membranaires : trafic vésiculaireFusion/fission membranaireEndocytoseVoie sécrétoireCanaux ioniquesTransporteursUniportsPompesCo-transporteursMoteurs moléculairesVoies de signalisation

Fusion vésiculaire : protéines SNARE Régulation des protéines SNARE Synaptotagmines : structure