Neurophysiologie : synapse
Vésicules synaptiques : cycle vésiculaire
Séparation de phase liquide-liquide (LLPS) et condensats

C'est par exemple la séparation de l'huile dans l'eau.

Séparation de phase liquide-liquide (LLPS)

Vue d'ensemble

En biologie cellulaire, c'est un processus où des molécules se séparent d'un mélange aqueux homogène en formant des structures distinctes qui sont souvent appelées condensats biomoléculaires ou organites sans membrane (Liquid phase condensation in cell physiology and disease 2017).

1. Le processus de séparation de phases est maintenant connu pour faciliter de nombreuses fonctions cellulaires complexes, entre autres (Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry 2016) :

• la réplication de l'ADN (Phase separation drives heterochromatin domain formation 2017),
• la transcription (Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains 2018),
• la signalisation (Phase separation of signaling molecules promotes T cell receptor signal transduction 2016)…

2. Les caractéristiques cruciales des biomolécules qui subissent une séparation de phases sont (Sequence Determinants of Intracellular Phase Separation by Complex Coacervation of a Disordered Protein 2016) :

• leur concentration élevée,
• leur capacité à s'engager dans des interactions multiples et à faible affinité telles que l'interaction entre les domaines SH3 et les domaines riches en proline (PRD).

3. Une telle phase dense des biomolécules peut concentrer spatialement certaines molécules tout en excluant d'autres (Compositional Control of Phase-Separated Cellular Bodies 2016).

Extension du LLPS aux organites

1. Les mécanismes de séparation de phases sont indépendants de la taille et ne sont pas limités aux acides nucléiques et aux protéines, mais comprennent également des cohortes d'organites.

a. La LLPS s'étend au réticulum endoplasmique (RE) et la voie sécrétoire précoce (DYRK3-Controlled Phase Separation Organizes the Early Secretory Pathway 2020),

b. L'appareil de Golgi est également concerné (The golgin family exhibits a propensity to form condensates in living cells 2020 et Liquid–liquid phase separation of the Golgi matrix protein GM130 2020).

La kinase à double spécificité DYRK3 joue un rôle clé dans le contrôle de la condensation intracellulaire de Sec16A et de plusieurs protéines de co-condensation de la voie sécrétoire précoce et son inhibition entraîne :

• un élargissement de l'ERES (Endoplasmic Reticulum Exit Sites) et une accumulation d'intermédiaires bourgeonnants et de vésicules COPII au niveau de l'ERES,
• un regroupement aberrant d'intermédiaires ERGIC et cis-Golgi gonflés sur ces sites.

4. De plus, l'activité biologique de certaines biomolécules dépend de leur capacité à former des condensats.

Par exemple, dans les neurones, la formation et le transport des granules d'ARN sont étroitement couplés à leur capacité à former des condensats biomoléculaires.

La viscosité des granules d'ARN détermine l'étendue de leur association avec des compartiments liés à la membrane tels que les lysosomes (RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether 2019).

Structures des protéines impliquées dans la LLPS

Région intrinsèquement désordonnée (IDR)

1. De nombreuses protéines impliquées dans la formation de condensats contiennent une région intrinsèquement désordonnée (IDR ou Intrinsic Disordered Region).

• Les IDR sont des suites d'acides aminés qui ne se replient pas dans une structure secondaire ou tertiaire stable.

• 

  Environ un tiers des protéines eucaryotes contiennent des IDR d'au moins 50 acides aminés de longueur (Classification of Intrinsically Disordered Regions and Proteins 2014).

2. De nombreuses protéines impliquées dans le recyclage des VS contiennent de longs IDR comme :

• l'α-synucléine (α-Synuclein in the Synaptic Vesicle Liquid Phase: Active Player or Passive Bystander? 2022),
• la synapsine,

a. Des séquences de consensus d'acides aminés pour se lier aux modules d'interaction protéine-protéine, telles que les motifs riches en proline (domaine PRD), se trouvent souvent dans ces régions.

b. La présence d'IDR est essentielle pour la séparation de phase de ces protéines, protéines dans lesquelles des patchs d'acides aminés particuliers modulent le recrutement de composants supplémentaires dans ces condensats par des interactions à faible et à haute affinité (Phase behavior of disordered proteins underlying low density and high permeability of liquid organelles 2017).

Remarque : les cavines possèdent aussi des IDR, i.e. DR1/23 qui sont à l'origine d'un modèle de remodelage membranaire ( oligomérisation des cavines).

3. Toutes ces protéines sont aussi impliquées dans les interactions dites " floues ", fuzzy en anglais, qui impliquent des interactions très dynamiques entre des protéines désordonnées ou à ambiguïté structurelle et favorisent des interactions protéine/protéine réversibles et adaptables.

Conséquences : interactions " floues " (fuzzi)

1. Les interactions dites " floues " (fuzzy en anglais) impliquent des interactions très dynamiques entre des protéines désordonnées ou à ambiguïté structurelle qui favorisent des interactions protéine/protéine réversibles et adaptables.

Nous ne développerons pas en détail ce concept en pleine évolution aujourd'hui, qui est envisagé par exemple pour la formation des cavéoles ( oligomérisation des cavines).

• Editorial: Fuzzy Interactions: Many Facets of Protein Binding (2022)
• The importance of the compact disordered state in the fuzzy interactions between intrinsically disordered proteins (2022)
• Fuzziness enables context dependence of protein interactions (2017)
• Behaviour of intrinsically disordered proteins in protein–protein complexes with an emphasis on fuzziness (2017)

1. Les transitions conformationnelles adaptatives associées au flou protéique permettent :

• le recâblage des réseaux d'interaction via des motifs alternatifs,
• de nouvelles caractéristiques fonctionnelles via des motifs allostériques,
• des changements fonctionnels lors de modifications post-traductionnelles,
• la régulation des organismes de commande.

2. Ces interactions floues sont aussi un moteur pour les phases de transition des protéines, i.e. passage entre les phases solubles, liquides, gel ou même solide (Protein Phase Separation: A New Phase in Cell Biology 2018).

a. Les régions de protéines intrinsèquement désordonnées (IDR) ont la capacité à promouvoir la séparation de phase liquide-liquide (LLPS), avec des fonctions biologiques majeures comme :

• la formation de granules de stress (SG), i.e. assemblages de ribonucléoprotéines cytoplasmiques (RNP) à phases séparées, sans membrane, dont la fonction principale est de favoriser la survie des cellules en condensant les ARNm bloqués par la traduction, les composants ribosomiques, les facteurs d'initiation de la traduction et les protéines de liaison à l'ARN (The Integral Role of RNA in Stress Granule Formation and Function 2021),
• l'assemblage de sous-structures nucléaires,
• la détection de changements dans l'homéostasie cellulaire,
• les structures présynaptiques.

b. La membrane plasmique et les surfaces des compartiments intracellulaires, comme le réticulum endoplasmique (RE) et les lysosomes, jouent un rôle dans la LLPS, agissant comme des sites de nucléation de gouttelettes ou comme plateformes pour le transport d'assemblages à phases séparées ( revue dans Cavin1 intrinsically disordered domains are essential for fuzzy electrostatic interactions and caveola formation 2021, références 23-34).

Les condensats biomoléculaires associés aux membranes phospholipidiques pourraient posséder des propriétés mécaniques émergentes pouvant entraîner la génération d'une courbure membranaire ( cavines et courbure membranaire).

3. De nombreuses protéines impliquées dans le trafic membranaire contiennent des domaines volumineux intrinsèquement désordonnés, qui occupent des volumes considérablement plus importants par rapport aux motifs structurés de poids moléculaire équivalent.

Conséquences sur la biologie neuronale et synaptique

Vue d'ensemble

Les terminaux nerveux contiennent des centaines de vésicules synaptiques (VS) qui sont étroitement groupées.

1. Les VS ont les propriétés d'une phase fluide dans laquelle les vésicules sont une composante de la phase et l'autre est les protéines de la matrice.

Le regroupement des VS est indépendant des protéines de la zone active (ZA) car la suppression des composants de la zone active n'abolit pas le regroupement en amont des VS (How to make an active zone: unexpected universal functional redundancy between RIMs and RIM-BPs 2016).

2. Bien qu'elles soient maintenues ensemble dans les différents pools, les vésicules sont très mobiles, de sorte qu'elles peuvent être rapidement recrutées dans la membrane plasmique neuronale pour libérer leur contenu lors de l'activation du neurone (Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles 2016).

Cette mobilité dans les boutons synaptiques suggère fortement que les VS forment un condensat plutôt que d'être réticulées en un échafaudage.

Protéines impliquées

Plusieurs protéines des vésicules synaptiques (VS) sont à l'origine des condensats pour intervenir dans différentes fonctions.

Synapsine et regroupement des VS

1. La synapsine, par ses domaines D et E, intrinsèquement désordonnés (IDR), suffit à induire la formation de micro-domaines de VS au sein du bouton synaptique, pour regrouper les vésicules lipidiques comme dans le pool de réserve ( synapsine et regroupement des VS).

Cela n'exclut pas un rôle supplémentaire par les interactions protéine-protéine comme avec :

• l'intersectine,
• l'α-synucléine.

Protéines de courbure et endocytose

1. Dans l'endocytose, plusieurs protéines de courbure reposent sur des interactions faibles et de type liquide pour favoriser l'assemblage de gouttelettes de protéines ( LLPS et endocytose).

Ce serait le cas de :

• Eps15 et Fcho1/2,
• l'endophiline, comme aussi dans le cas de l'endocytose rapide endophiline-dépendante (FEME),
• la dynamine 1 par son interaction avec la syndapine 1 pour former des condensats moléculaires pour la médiation de l'endocytose ultrarapide (UFE) au niveau des synapses ( dynamine et UFE).

2. Les interactions cohésives au sein des condensats et les tensions interfaciales entre les condensats, les membranes et le cytosol pourraient contribuer à l'invagination membranaire au cours de l'endocytose dépendante et indépendante de l'actine.

Échafaudage présynaptique

Les protéines d'échafaudage présynaptique RIM et RIM-BP forment des condensats auto-assemblés par des séparations de phase liquide-liquide.

Ces condensats sont capables de regrouper les canaux calciques en grappes sur les membranes lipidiques.

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