Nucléotides
Biosynthèse des désoxyribonucléotides

1. Les désoxyribonucléotides sont composés :

a. d'une base hétérocyclique azotée ou nucléobase, responsable des propriétés d’appariement et de reconnaissance moléculaire dans les acides nucléiques :

• soit une base purique, l'adénine (A) ou la guanine (G) principalement,
• soit une base pyrimidique, la cytosine (C) ou la thymine (T) spécifique à l'ADN.

b. du désoxyribose, ose à 5 carbones (pentose),

c. un ou plusieurs groupes phosphate, responsables de la charge négative de la molécule et impliqués dans la formation des liaisons phosphodiester entre nucléotides successifs.

Remarque : l'uracile peut apparaître dans l’ADN par désamination spontanée de la cytosine, mais il est normalement éliminé par le mécanisme de réparation par excision de base (BER ou Base Excision Repair).

2. La biosynthèse des désoxyribonucléotides ne commence pas à partir des bases ou des oses libres, mais repose en général sur la réduction des ribonucléotides.

Elle nécessite la réduction de l'hydroxyle ($\ce{OH}$) du ribose en 2' qui a lieu sur les ribonucléosides diphosphates (ADP, GDP, UDP, CDP) par la ribonucléotide réductase (RNR),

Remarque : un cas particulier est la formation du désoxythymidine monophosphate (dTMP), qui ne résulte pas de la réduction d’un ribonucléotide contenant la thymine, car il n’existe pas de ribonucléotide naturel correspondant (pas de TDP ni de TTP d’origine ribosique).

Le dTMP est formé par méthylation du dUMP (biosynthèse du dTMP).

Biosynthèse de l'ADP, du dGDP, du dCDP et do dUDP

Vue d'ensemble

Les ribonucléotides diphosphates, i.e. ADP, GDP, CDP et UDP, sont réduits par un système enzymatique, la ribonucléotide réductase (RNR) ou ribonucléoside diphosphate réductase (rNDP), EC 1.17.4.1, en désoxyribonucléotides diphosphate (dADP, dGDP, dCDP et dUDP).

$\ce{Ribonucléoside diphosphate + thiorédoxine réduite}$ $\leftrightharpoons$
$\ce{2'-désoxyribonucléoside diphosphate + thiorédoxine oxydée + H2O}$

Remarque : le TDP n'existe pas car la thymine n’est pas présente dans les ribonucléotides, i.e. la voie de synthèse passe par le dTMP (biosynthèse du dTMP).

1. Cette biosynthèse, strictement conservée chez tous les organismes vivants, qui élimine le groupe 2'-hydroxyle du ribose des nucléotides diphosphates (Ribonucleotide reductase and the regulation of DNA replication: an old story and an ancient heritage 2007) :

• est essentielle à la synthèse de l'ADN et à sa réparation,
• permet de maintenir la quantité d’ADN proportionnelle à la masse cellulaire, condition cruciale pour la prolifération cellulaire.

Son activité est finement régulée selon le cycle cellulaire et les besoins en dNTP.

Remarque : chez les eucaryotes, la RNR agit exclusivement sur les NDP, et non les NTP.

Chez certaines bactéries, la réduction peut aussi s’effectuer au niveau des NTP via une ribonucléoside-triphosphate réductase (EC 1.17.4.2), mais ce mécanisme est beaucoup plus rare.

2. Les ribonucléotide réductases (RNRs) sont classées en trois grandes classes (I, II, III), en fonction (Ribonucleotide Reductases: Divergent Evolution of an Ancient Enzyme 2002) :

• du type de radical généré,
• du cofacteur métallique utilisé,
• des conditions d’oxygène.

a. Les RNR de classe I, actives en présence d'oxygène chez les eucaryotes, les bactéries et les virus, utilisent un centre di-ferrique qui génère un radical tyrosyle stable ( site actif).

b. Les RNR de classe II et III, retrouvées chez les archées, les bactéries et les bactériophages, sont actives dans des conditions anaérobies (classification).

Structure de la RNR

La ribonucléotide réductase (RNR) de classe I forme un complexe tétramérique α2β2, constitué de deux dimères αβ (Ribonucleotide Reductases 1998 et Structure, function, and mechanism of ribonucleotide reductases 2004 et Structural interconversions modulate activity of Escherichia coli ribonucleotide reductase 2011) :

• une grande sous-unité (R1 ou α), constituée de trois domaines et codée par le gène RRM1,
• une petite sous-unité (R2 ou β), constituée de deux domaines séparés et codée par les gènes RRM2 ou RRM2B, correspondant à deux isoformes de la sous-unité β.

Sites allostériques

Cette enzyme comprend deux types de sites allostériques, incorporés tous deux dans la grande sous-unité (R1).

1. Les sites de spécificité de substrat (specificity site), à grande affinité, lient un désoxyribonucléotide triphosphate, i.e. ATP ou dATP, dGTP, dTTP, qui détermine la préférence du substrat.

• Ce site oriente le choix du substrat, ADP, GDP, CDP et UDP, qui sera réduit.
• Ce processus permet d’assurer l’équilibre des différents dNTP cellulaires.

2. Un site de régulation ou d'activité (activity site), à faible affinité, lie :

• soit l'ATP pour activer la RNR,
• soit la dATP pour l'inhiber.

Cette régulation adapte l'activité de la RNR en fonction du taux de croissance de la cellule et du cycle cellulaire.

Par exemple, en cas d’accumulation de dATP, la synthèse de nouveaux dNTPs est arrêtée pour éviter les déséquilibres.

Site actif

1. Le site actif de la ribonucléotide réductase (aussi appelé substrate binding site) est situé dans la grande sous-unité R1.

Il lie les substrats ribonucléotidiques diphosphates et les présente à une cystéine catalytique essentielle à la réaction de réduction.

2. La petite sous-unité R2 contient un centre di-ferrique qui génère un radical tyrosyle stable (Tyr•).

a. Le centre di-ferrique (Fe-Fe) contient initialement des ions ferreux (Fe⁺⁺).

• En présence d’oxygène moléculaire, l'ion ferreux est oxydé et le complexe devient (Fe⁺⁺⁺-Fe⁺⁺⁺).
• Cette réaction produit un radical tyrosyle stable (Tyr•) sur un résidu spécifique de tyrosine (Tyr176 chez l'homme et Tyr122 chez Escherichia coli) proche du centre métallique.

b. Tyr•, essentiel à l’initiation du processus catalytique, est transféré de la sous-unité R2 vers le site actif de R1 via une chaîne de résidus aromatiques où il active ensuite la cystéine catalytique (Cys 429 chez l'homme et Cys439 chez Escherichia coli).

• Le transfert à longue distance se fait via un tunnel protéique de ~35 Å, constitué d’une chaîne de résidus aromatiques (principalement tyrosines et tryptophanes) organisés en une voie de transfert d’électrons par sauts de radicaux (radical hopping).
• Cette architecture unique permet de transmettre le radical sans diffusion libre, assurant à la fois rapidité, spécificité et contrôle du processus.

Nucléotide lié au site de spécificité	Substrat réduit	Produit formé
ATP ou dATP	CDP UDP	dCDP dUDP
dTTP	GDP	dGTP
dGTP	ADP	dADP

3. Cys 449 permet l’initiation de la catalyse, au cours de laquelle le groupement 2'-hydroxyle du ribose est remplacé par un atome d’hydrogène, formant ainsi un désoxyribonucléotide diphosphate (dNDP).

Génération des dNDP

1. Lorsque la RNR est activée, i.e. l'ATP se fixe sur le site de régulation de R1, la réaction dépend du NDP lié au site de spécificité. 

2. Ces dNDP, i.e. dADP, dGDP, dCDP et dUDP, seront ensuite phosphorylés en dNTP pour la synthèse d’ADN (transfert du groupe phosphate sur les NDP).

Mécanisme

Mécanisme général

Le mécanisme de la réduction des ribonucléotides en désoxyribonucléotides accepté à l'heure actuelle est le suivant (Dehydration of Ribonucleotides Catalyzed by Ribonucleotide Reductase: The Role of the Enzyme 2006).

1. Extraction de $\ce{H}$ du groupe alcool ($\ce{-OH}$) de C3' du ribose.

• Le radical tyrosyle $\ce{TyrO^{\bullet}}$, généré dans la sous-unité R2, est transféré à la cystéine catalytique Cys439 chez Escherichia coli de R1, formant un radical thiyl ($\ce{S^\bullet}$).
• Ce radical thiyl arrache l’atome d’hydrogène en position 3' du ribose du substrat.

2. Élimination d'une molécule d'eau $\ce{H2O}$.

Les résidus Cys225, Cys462 et Glu441 participent à l’élimination du groupe hydroxyle en C2' du ribose.

3. Un proton est transféré du résidu Cys225 vers le carbone C-2' du substrat ribonucléotidique.

a. Ce transfert est activé par un passage de proton depuis Cys462 vers Cys225, via une chaîne de transfert de protons.

b. À la fin de cette étape, on obtient :

• un pont disulfure anionique radicalaire $\ce{S_{\bullet}^--S}$ (Cys225–Cys462) sur l’enzyme,
• un intermédiaire cétone en configuration fermée (closed-shell), c’est-à-dire une molécule sans électron non apparié (non radicalaire) sur le substrat.

4. Le pont disulfure anionique (Cys225-Cys462) formé est oxydé, i.e. passe de la forme anionique et radicalaire à un pont disulfure stable.

• Simultanément, un proton est transféré de Glu441 au carbone C-3' du substrat.
  
• Le radical est alors transféré du carbone C-3' vers le résidu Cys439 du site actif.

Cela stabilise le radical carboné en C-3', maintenant un équilibre électronique.

5. La dernière étape est l'inverse de la première étape et implique :

• la récupération de l'atome d'hydrogène de la Cys439 par le radical C3', reformant un ribose réduit (désoxy),
• la régénération du radical thiyl $\ce{S^\bullet}$.

6. Régénération du radical initial et obtention du désoxyribonucléotide.

• Le radical thiyl sur Cys439 est recyclé : il retourne vers la tyrosine radicalaire de R2, ce qui boucle le cycle catalytique.
• Le désoxyribonucléotide (dNDP) est libéré du site actif.
• Les cystéines Cys225 et Cys462 sont ensuite réduites par le système thiorédoxine/thioredoxine réductase/NADPH, régénérant l’enzyme pour un nouveau cycle catalytique.

Conclusion : ce mécanisme est radicalaire, c’est-à-dire qu’il repose sur la formation transitoire d’un radical tyrosyle possédant un électron non apparié, capable d’arracher un atome d’hydrogène au ribose du substrat.

Il diffère de celui de la plupart des enzymes qui catalysent des réactions par des mécanismes ioniques impliquant des intermédiaires chargés (carbocations ou carbanions).

En outre, ce radical est strictement confiné dans le site actif de l’enzyme et transféré entre résidus spécifiques, ce qui empêche toute diffusion de radicaux libres dans la cellule et évite ainsi les dommages à l'ADN ou aux protéines environnantes.

Interconnection avec le système de la thiorédoxine réductase

La ribonucléotide réductase (RNR) catalyse la réduction des NDP en dNDP, mais elle-même dépend d’un système réducteur externe pour fonctionner correctement.

1. Ce système comprend deux composants.

• 

a. La thiorédoxine réductase (TrxR) :

• comprend le FAD (flavine adénosine diphosphate), un groupe prostéthique,
• utilise le NADPH (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate) comme coenzyme donneur d’électrons.

b. la thiorédoxine (Trx), i.e. protéine à cystéines qui réduit directement les cystéines oxydées dans le site actif de la RNR.

1. La thiorédoxine réductase, i.e. TrxR-S₂, est réduite par le NADPH.

$\ce{TrxR-S2 + NADPH + H+}$ $\longrightarrow$ $\ce{TrxR-(SH)2 + NADP+}$

Remarque : le FAD agit comme intermédiaire redox et sert de médiateur dans le transfert d'électrons entre le NADPH et le site actif disulfure de la TrxR ( mécanisme de la TrxR).

2. La thiorédoxine (Trx) est réduite par TrxR-(SH)₂.

$\ce{Trx-S2 + TrxR-(SH)2}$ $\longrightarrow$ $\ce{Trx-(SH)2 + TrxR-S2}$

3. La thiorédoxine réduite (Trx-(SH)₂) réduit la ribonucléotide réductase (RNR).

$\ce{RNR-S2 + Trx-(SH)2}$ $\longrightarrow$ $\ce{RNR-(SH)2 + Trx-S2}$

La RNR est régénérée sous sa forme active, i.e. avec ses cystéines réduites, et peut à nouveau catalyser la réduction des ribonucléotides.

Biosynthèse du dTMP et formation du dTDP

Formation du dTMP à partir du dUMP

1. La synthèse du dTMP s'effectue à partir du dUMP (désoxyuridine-monophosphate), car la thymine, qui donne naissance au dTMP (désoxythymidine monophosphate), n’a pas de forme ribonucléotidique naturelle (contrairement aux autres bases).

1. Le dUMP provient :

a. soit de la déphosphorylation du dUDP par une nucléoside-diphosphatase (NDPase), i.e. le dUDP étant obtenu par réduction de l'UDP par la ribonucléotide réductase ou RNR (biosynthèse des dNDP),

$\ce{dUDP}$ $\longrightarrow$ $\ce{dUMP + Pi}$

b. soit de la désamination enzymatique du dCMP par la dCMP désaminase (EC 3.5.4.12).

$\ce{dCMP + H2O + H+}$ $\longrightarrow$ $\ce{dUMP + NH4+}$

c. Ces deux voies assurent une régulation fine du pool de dUMP pour la synthèse de dTMP.

2. Le dUMP est ensuite méthylé grâce à l'intervention de la thymidylate synthase (EC 2.1.1.45).

$\ce{dUMP + N5,N10-méthylènetétrahydrofolate (CH_2-THF) }$ $\leftrightharpoons$ $\ce{dTMP + dihydrofolate (DHF)}$

• Le donneur de méthyle est le N5,N10-méthylènetétrahydrofolate (CH₂-THF), lui-même dérivé du folate (vitamine B₉).
• Lors du transfert du groupe méthyle, il est oxydé en 7,8-dihydrofolate (DHF).

3. La régénération du CH₂-THF est nécessaire pour la poursuite de la synthèse du dTMP.

Régénération du CH₂-THF

La régénération du CH₂-THF se fait en deux étapes.

1. La régénération du THF (DHFR) s'effectue par la réduction du DHF par la dihydrofolate réductase (DHFR), i.e. EC 1.5.1.3, enzyme qui utilise le NADPH comme donneur d'électrons.

$\ce{DHF + NADPH +H+}$ $\leftrightharpoons$ $\ce{THF + NADP+}$

Remarque : la DHFR est une cible thérapeutique majeure car elle est inhibée par des analogues structuraux du dihydrofolate, qui, en bloquant la régénération du CH₂-THF, inhibent la méthylation du dUMP en dTMP, ce qui provoque l'arrêt de la synthèse d’ADN et la mort cellulaire (médicaments et métabolisme des nucléotides).

2. Le THF régénéré est ensuite reconverti en CH₂-THF grâce à la sérine hydroxyméthyltransférase (SHMT), i.e. EC 2.1.2.1, une enzyme phosphate pyridoxal (PLP)-dépendante, forme active de la vitamine B₆, qui catalyse la réaction suivante :

$\ce{THF + L-sérine}$ $\leftrightharpoons$ $\ce{CH2-THF + glycine}$

Remarque : la disponibilité en folates (vitamine B₉) et en vitamine B₆ est indispensable à la synthèse de dTMP, via son rôle dans la formation du CH₂-THF.

Le déficit en dTMP provoque l’incorporation erronée de l'uracile dans l’ADN, suivie de tentatives de réparation inefficaces qui conduisent à des cassures simple ou double brin de l’ADN à l'origine de nombreux troubles ( carence en folate).

Formation du dTDP

Le dTDP (désoxythymidine diphosphate) est formé par phosphorylation du dTMP grâce à la thymidylate kinase, i.e. EC 2.7.4.9 (transfert du groupe phosphate sur les NMP) :

$\ce{dTMP + ATP}$ $\leftrightharpoons$ $\ce{dTDP + ADP}$

Transformations des désoxyribonucléotides diphosphates (dNDP)

1. Les désoxyribonucléotides diphosphates (dNDP), formés à partir des ribonucléotides diphosphates (NDP), constituent des intermédiaires centraux du métabolisme des désoxyribonucléotides.

• Les dNDP peuvent produire des dNTP par la nucléoside-diphosphate kinase ou NDPK (EC 2.7.4.6).
• La réaction inverse de déphosphorylation, catalysée notamment par les NDPases, conduit aux dNMP.

2. À partir de ces intermédiaires, des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation peuvent intervenir sur l’ensemble des désoxyribonucléotides, permettant la conversion entre dNMP, dNDP et dNTP selon les besoins métaboliques de la cellule.

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