Trafic vésiculaire : endocytose clathrine-dépendante (CME)
7a. Déshabillage de la vésicule : Hsc70/HSPA8

7. Le déshabillage de la vésicule (uncoating) via des facteurs cytosoliques est une étape indispensable au trafic des vésicules, car le manteau gène l’interaction avec les endosomes précoces.

Ce déshabillage nécessite :

• Hsc70/HSPA8 (70 kDa), protéine appartenant à la famille des protéines de choc thermique et des protéines chaperons ;
• plusieurs protéines qui sont présentées comme des co-chaperons de Hsc70, dont l'auxilline/GAK(A sequential mechanism for clathrin cage disassembly by 70-kDa heat-shock cognate protein (Hsc70) and auxilin 2011).

L'assemblage est relativement stable alors que le démontage est très rapide : le cycle complet ne dure que 30 à 60 secondes.

L'habillage de la vésicule sera ensuite recyclé.

Vue d'ensemble du
déshabillage de la
vésicule de clathrine

Vue d'ensemble

1. Quand la vésicule est entièrement internalisée, elle perd rapidement son revêtement de clathrine, i.e. en quelques secondes, pour pouvoir fusionner plus facilement avec les endosomes précoces.

• Malgré l'intrication des triskélions, le démontage est très rapide : la seule rotation d'un triskélion autour de son axe peut le désolidariser du manteau, et sa forme lui permet de ne pas interférer avec ceux qui demeurent dans la structure.
• In vivo, ce processus commence dans les 5 secondes suivant le détachement de la membrane : rappelons que le cycle complet ne dure que 30 à 60 secondes.

2. Ce déshabillage nécessite tout d'abord Hsc70/HSPA8, ATPase qui va fournir l'énergie pour le déshabillage ( cf. plus bas).

3. Pour déshabiller la cage de clathrine, Hsc70 doit être recrutée par des co-chaperons de deux types.

a. Des protéines à domaine J (JDP), comme l'auxilline/GAK, stimulent l'hydrolyse de l'ATP par Hsc70, et contiennent des sites de liaisons aux substrats concernés,

b. Des facteurs d'échange de nucléotides (NEF), dont le rôle est identique aux GEF (Guanine nucleotide exchange factor), favorisent le remplacement de l'ADP lié à l'Hsc70 par l'ATP (The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones 2015).

Les bactéries et les organites d'origine bactérienne ont un seul type connu de NEF pour Hsp70, le GrpE bactérien, alors que, pour les cellules eucaryotes, un grand nombre de NEF, appartenant aux familles de protéines de domaine Hsp110/Grp170, HspBP1/Sil1 et BAG, ont été découvertes.

Et les phospholipides ?

La composition en phosphoinositides d'une vésicule d'endocytose reste inchangée, malgré une augmentation de PI(3,4)P2 au début de sa formation, jusqu'au moment de la séparation de la membrane plasmique. Elle subit ensuite une série bien définie de modifications séquentielles (Dynamics of phosphoinositide conversion in clathrin-mediated endocytic traffic 2017 et Dynamics of Auxilin 1 and GAK in clathrin-mediated traffic 2020)

Une série programmée de conversions de phosphoinositides accompagne les différentes étapes du cycle d'assemblage-désassemblage de clathrine dans le trafic membranaire endocytaire.

• Ces conversions, avec des demi-temps de 1 à 5 s, dépendent de la fermeture de la vésicule et leur apparition crée un signal moléculaire indiquant que la scission est terminée.
• Une cascade de dépendances conduit à d'autres signaux moléculaires, dont l'accumulation de PI(3,4)P2 qui annoncerait le déshabillage et entraînerait l'arrivée de la petite GTPase Rab5 régulateur principal de la dynamique des endosomes précoces.

Hsc70/HSPA8

Hsc70 (70 kDa) est une protéine appartenant à la famille (HSPA8/HSC70 chaperone protein 2013) :

• des protéines de choc thermique ou protéines de stress (HSP ou Heat-Shock Protein), et en particulier des Hsp70 ou DnaK (The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones 2015), i.e. protéines produites par les cellules en réponse à un stress, en particulier, lors de leur découverte, à la dénaturation thermique, d'où leur nom, mais aussi au froid, aux UV ou pendant la cicatrisation des plaies ou le remodelage des tissus,

• 

  des protéines chaperons : protéines associées à la protection, le maintien et la régulation des fonctions des protéines auxquelles elles sont associées (il existe d'autres protéines chaperons qui ne sont pas des protéines de choc thermique).

Structure de Hsc70

Hsc70 facilite le pliage des protéines pour les protéger, en cachant les acides aminés hydrophobes souvent impliqués dans les agrégations des protéines.

Hsc70 est constitué de trois domaines.

1. Le domaine N-terminal (NBD : Nucleotide Binding Domain 44kDa) est un domaine ATPase, constitué de 4 sous-domaines (IA, IB, IIA, and IIB), divisé en deux lobes séparés par une profonde fente nucléotidique (comme dans toutes les ATPases).

L'hydrolyse de l'ATP en ADP et Pi conduit à des changements conformationnels des autres domaines.

2. Un lien (linker est présent entre les deux domaines.

3. Le domaine de fixation au substrat (SBD : Substrate Binding Domain 24 kDa) est composé par :

• un sous-domaine en feuillet β (β sheet), formant classiquement un tonneau β (beta barrel) qui entoure le substrat concerné, et un sous-domaine hélicoïdal α.

SBD contient une fente qui peut accueillir des peptides de 5-7 acides aminés, en général hydrophobes, avec une préférence particulière pour la séquence FYQLALT.

• un sous-domaine C-terminal, domaine constitué de plusieurs hélices α, qui stabilise la structure interne et agit comme un " couvercle " pour maintenir le substrat dans le tonneau.

4. HSc70 doit se fixer au motif QLMLT des chaînes lourdes de clathrine : les domaines C-terminaux des triskélions forment une cavité en forme d'entonnoir contennant un motif QLMLT (résidus 1638–1642 chez les mammifères) qui permet une liaison optimale au SBD ( Substrate Binding Domain) de la protéine Hsc70 (A Motif in the Clathrin Heavy Chain Required for the Hsc70/Auxilin Uncoating Reaction 2007 et The structures of natively assembled clathrin-coated vesicles 2020).

Mécanisme de chaperon

1. Le domaine de connexion entre le NBD (Nucleotide Binding Domain) et le SBD (Substrate Binding Domain) est une hélice flexible qui permet le déplacement des deux domaines de 35° l'un par rapport à l'autre et favorise leur rapprochement.

Bien que les fonctions de liaison du NBD et du SBD sont séparables, l'activité de chaperon Hsp70 dépend strictement du couplage serré de ces deux domaines par la liaison de l'ATP, ce qui conduit à la modulation de leurs activités (Hsp70 chaperone dynamics and molecular mechanism 2013).

• 

  L'ATP réduit considérablement l'affinité des peptides pour les substrats peptidiques en accélérant à la fois les taux de libération et de liaison.
• Dans le même temps, la liaison du peptide stimule la vitesse d'hydrolyse de l'ATP.

Grâce à ce couplage, l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP est efficacement utilisée pour la régulation de la liaison et de la libération du peptide du substrat, i.e. le chaperon est efficace.

2. La fonction de chaperon de Hsp70 est corrélée à la transition entre les conformations ouvertes et fermées du SBD, régulée par le mécanisme allostérique de rapprochement avec le NBD en liaison avec le cycle ATPasique (Solution conformation of wild-type E. coli Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate 2009).

Mécanisme général

1. Quand l'Hsc70 est couplé à l'ADP, il est en équilibre entre la conformation fermée et une conformation ouverte très transitoire.

2. Les facteurs d'échange de nucléotides (NEF) catalysent la dissociation de l'ADP et la liaison de l'ATP à Hsc70 provoque :

• a. la rotation des lobes NBD l'un vers l'autre,
• b. l'ouverture de la fente inférieure du NBD,

• 

  c. l'insertion du lien interdomaine et l'ancrage de SBDβ au NBD, entraînant
• d. l'ouverture du couvercle α-hélicoïdal (SBDα),
• e. la libération du substrat.

3. Quand l'Hsc70 est couplé à l'ATP, il est en équilibre entre la conformation fermée et une conformation ouverte très transitoire : les boucles externes du SBDβ sont très dynamiques.

4. Les substrats s'associent aux protéines à domaine J (JDP), comme l'auxilline/GAK, , et se lient à la conformation ouverte de Hsp70 (Structure of clathrin coat with bound Hsc70 and auxilin: mechanism of Hsc70‐facilitated disassembly 2009).

5. La liaison du substrat induit la fermeture du SBDα et la dissociation du SBDβ du NBD, ce qui permet la rotation des lobes NBD pour une hydrolyse optimale de l'ATP.

• Les substrats stimulent l'hydrolyse de l'ATP à travers une voie distincte impliquant un déclenchement sur le NBD .
• La façon dont les JDP agissent en synergie avec les substrats n'est actuellement pas bien connue bien que des avancées récentes ont permis de soulever certains voiles (Molecular Mechanism of J-Domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones 2018).

Co-chaperons de Hsc70 et mécanisme du déhabillage