Transport membranaire
Transports sans mouvements membranaires
Transporteurs actifs : co-transporteurs (transporteurs secondaires)
AE1 ou Band 3 (Bande 3)
Interactions : complexes membranaires et hémoglobine

Domaine N-terminal

Le domaine N-terminal, cytosolique (appelé cdB3), domaine hélical parallèle à la membrane plasmique, comprend deux domaines (Crystallographic structure and functional interpretation of the cytoplasmic domain of erythrocyte membrane band 3 2000) :

1. Le domaine de dimérisation N-terminal est formé par des interactions très larges (5200 Å2) entre les monomères.

• Pour chaque monomère, une hélice (résidus 314-344) interagit avec celle de son homologue.
• De nombreuses liaisons hydrogène et des leucines stabilisent le dimère.

Les domaines isolés, qu'ils soient N-terminaux ou membranaires, sont dimériques (dimérisation des domaines membranaires).

Un article récent a décrit la structure à une résolution de 2,8 Å du domaine N-terminal régulateur du NDCBE humain (sodium-driven chloride/bicarbonate exchanger ou SLC4A8), cotransporter electroneutre sodium-bicarbonate, essentiel pour maintenir le pH neuronal dans les neurones (The crystal structure of the regulatory domain of the human sodium-driven chloride/bicarbonate exchanger 2017).

2. un domaine d'interaction, point d'ancrage pour de nombreuses protéines :

• à l'ankyrine (bande 2,1) qui ancre le cytosquelette membranaire à la membrane,
• à l'hémoglobine,
• à plusieurs enzymes glycolytiques.

Band 3 joue un rôle essentiel dans les échanges O₂/CO₂ au niveau de l'érythrocyte par son mécanisme échangeur d'ions et son action sur la désoxyhémoglobine (interactions avec l'hémoglobine).

Liaisons dans les complexes
membranaires

Band 3 entre en interaction avec les complexes qui relient le cytosquelette d'actine à la membrane érythrocytaire par deux ponts différents :

• les complexes d'ankyrine,
• les complexes jonctionnels d'actine.

Ces complexes, qui ont un rôle fondamental dans la forme des érythrocytes et la régulation de leurs propriétés mécaniques, sont formés de nombreuses protéines : leur position relative n'est pas connue avec précision et leur proportion est variable, ce qui est logique vu la variabilité des contraintes.

Complexes d'ankyrine

Liaison à l'ankyrine

1. L'ankyrine possède deux sites de liaison à la bande 3, l'un sur les sous-domaines 7-12 et l'autre sur les sous-domaines 13-24 : elle pourrait lier alors deux dimères pour former des tétramères (The ANK Repeats of Erythrocyte Ankyrin Form Two Distinct but Cooperative Binding Sites for the Erythrocyte Anion Exchanger 1995).

La liaison de l'ankyrine à la spectrine, elle-même liée, par son domaine ABD (Actin Binding Domain) N-terminal, composé de 2 domaines CH (Calponin Homology), à l'actine, permet un premier pont entre la membrane et le cytosquelette.

2. La liaison de Band 3 avec l'ankyrine est constituée par (Identification of contact sites between ankyrin and band 3 in the human erythrocyte membrane 2013) :

• une boucle comprenant les résidus 175-185 constitue le site d'ancrage,
• une boucle adjacente, comprenant des résidus 63-73, contribue aussi à cette liaison.

Cette liaison est réalisée par de nombreux ponts salins et des contacts hydrophobes entre les deux protéines :

• Lys69 de Band 3 à Glu645 de l'ankyrine,
• Glu72 à Lys611,
• Asp183 à Asn601 et Gln634.

D'autres sont moins essentiels : Lys160/His579, Arg155/Asn568, Glu151/Lys535, Thr126/Thr500 et Gln124/Asp 649.

Liaison à la protéine 4.2

La protéine 4.2 (Band 4.2) est une protéine de liaison à l'ATP qui se lie à la fois à Band 3 et à l'ankyrine pour renforcer le lien membrane/cytosquelette.

• 

  Elle fait partie des transglutaminases, mais n'a pas d'activité catalytique (Interactions of Recombinant Mouse Erythrocyte Transglutaminase with Membrane Skeletal Proteins 2006).
• Elle est myristoylée sur Gly2 et palmitoylée sur Cys173, ce qui permet son ancrage membranaire.

1. La région N-terminale de la protéine 4.2 (résidus 1-238) semble impliquée dans la liaison avec Band 3, mais les études diffèrent sur la localisation exacte du site de liaison.

• Les résidus 157-181 forment une épingle-à cheveux (β-hairpin) au centre de la protéine 4.2 comprenant Cys173 qui serait le lieu de l'interaction (Mapping of a palmitoylatable band 3-binding domain of human erythrocyte membrane protein 4.2 1999).
• Les résidus 200-211 pourraient aussi convenir (Associations of protein 4.2 with band 3 and ankyrin 2006 et Protein-4.2 association with band 3 (AE1, SLCA4) in Xenopus oocytes: effects of three natural protein-4.2 mutations associated with hemolytic anemia 2005).
• Les résidus 33-45 de la protéine 4.2, contenant Arg34 et Arg35 basiques, entreraient en interaction avec l'extrémité N-terminale de Band 3 (Identification of a band-3 binding site near the N-terminus of erythrocyte membrane protein 4.2 1996).

En tout cas, la liaison doit être étendue car les mutations E40K, G130R et P327R de Band 3 affectent tous, les niveaux de protéine 4.2 dans les érythrocytes (Protein 4.2 interaction with hereditary spherocytosis mutants of the cytoplasmic domain of human anion exchanger 1 2011).

2. Quant à l'ankyrine, ce serait les résidus 187-200 qui seraient impliqués (Associations of protein 4.2 with band 3 and ankyrin 2006).

3. En outre, la protéine 4.2 se lie au complexe jonctionnel d'actine (cf. plus bas).

Complexes jonctionnels d'actine

1. Le squelette de la membrane des globules rouges forme un réseau à peu près hexagonal composé principalement de courts filaments d'actine-F réticulés par des hétérotétramères de spectrine α2/β2 avec l'aide de la protéine 4.1 (Band 4.1 ou EPB41).

• L'actine et la protéine 4.1 se lient au domaine de liaison à l'actine (domaine ABD formé de 2 domaines CH) situé à l'extrémité N-terminale de la chaîne β de la spectrine.
• L'extrémité carboxy-terminale de l'α-spectrine contient un domaine EF (main EF), ressemblant à la calmoduline, avec des EF-mains dépendantes du calcium et indépendantes du calcium dont le rôle n'est pas bien établi.

Le complexe jonctionnel est formé par :

• un complexe cytosquelettique formé par la spectrine, l'actine et la protéine 4.1, mais aussi l'adducine, la dématine, la tropomyosine, la tropomoduline et le p55 ;
• un complexe de protéines membranaires intégrales contenant diverses combinaisons de la bande 3, du transporteur de glucose 1, des glycoprotéines Kell et Duffy, de la protéine Rh, de la protéine XK et de la glycophorine C (Dematin and Adducin Provide a Novel Link between the Spectrin Cytoskeleton and Human Erythrocyte Membrane by Directly Interacting with Glucose Transporter-1 2008 et Protein 4.1R-dependent multiprotein complex: New insights into the structural organization of the red blood cell membrane 2008).

2. Band 3 se lie à la queue de l'adducine (Adducin forms a bridge between the erythrocyte membrane and its cytoskeleton and regulates membrane cohesion 2009).

a. Les adducines (1-4) sont composées (Erythrocyte adducin: A structural regulator of the red blood cell membrane 2010).

• 

  d'un domaine N-terminal globuleux (head ou tête),
• d'un cou (neck),
• d'une queue C-terminale (tail domain) qui comprend un domaine MARKS (Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate, semblable aux protéines MARKS).

b. Le domaine MARKS interagit avec l'actine, la spectrine, la calmoduline et Band 3 et sa phosphorylation inhibe ses liaisons (X MARCKS the spot: myristoylated alanine-rich C kinase substrate in neuronal function and disease 2015).

• L'adducine est une protéine de coiffe de l'actine qui se lie aussi au complexe Ca⁺⁺/calmoduline (A new function for adducin. Calcium/calmodulin-regulated capping of the barbed ends of actin filaments 1996).
• Les adducines interviennent aussi dans la stabilité du cortex cellulaire, dans l'adhérence cellulaire et dans la construction du fuseau de division (mitotique) grâce à la myosine X (Adducin-1 is essential for mitotic spindle assembly through its interaction with myosin-X 2013),

3. La protéine 4.2 se lie, outre sa liaison avec Band 3 et l'ankyrine, avec (Protein 4.2 Binds to the Carboxyl-terminal EF-hands of Erythroid α-Spectrin in a Calcium- and Calmodulin-dependent Manner 2010) :

• l'extrémité de la β-spectrine pour réticuler les protofilaments d'actine-F,
• l'extrémité de l'α-spectrine qui contient un domaine EF (main EF).

Cette liaison n'interfère pas avec l'interaction Band 3/Band 4.2.

Interactions avec l'hémoglobine

Interaction avec la désoxyhémoglobine

Band 3 se fixe sur la désoxyhémoglobine (désoxyHb), mais pas l'oxyhémoglobine (Characterization of the deoxyhemoglobin binding site on human erythrocyte band 3: implications for O2 regulation of erythrocyte properties 2007).

• La désoxyHb ne se lie qu'aux résidus 12-23 de Band 3.

• 

  Le site de liaison de Hb sur la bande 3 se trouve à proximité de sites de liaison pour des enzymes glycolytiques, la bande 4.1 et l'ankyrine, ce qui suggère que de multiples propriétés érythrocytaires pourraient être régulées par l'état d'oxygénation de la cellule.

1. La désoxyhémoglobine, forme désoxygénée, possède une conformation dite T ou tendue. Elle possède une faible affinité pour l'oxygène (O₂), i.e. elle a tendance à le libérer lorsque le sang circule à travers les tissus.

La forme T est favorisée quand le pH est faible (acide), la concentration en dioxyde de carbone (CO₂) forte, un taux élevé en 2,3-bisphosphoglycérate (2,3-BPG) qui stabilise cette forme d'Hb, i.e. favorise la libération d'O₂ de la forme R.

a. Les résidus NH₂-terminaux de Band 3 (les 55 derniers) sont non structurés (Reversible binding of hemoglobin to band 3 constitutes the molecular switch that mediates O2 regulation of erythrocyte properties 2013).

• Ce segment anionique hautement flexible s'insère parfaitement dans la cavité centrale cationique de la forme T, exploitant la symétrie moléculaire et la polarité positive en formant des ponts salins avec des résidus de lysine et d'histidine dans les sous-unités β de l'hémoglobine (composés à liaison phosphate riche en énergie).
• CO₂ se lie plus facilement à la désoxyhémoglobine, ce qui facilite son élimination de l'organisme (effet Haldane).

b. En outre, Le CO₂ dissous dans le sang entre en interaction avec l'eau (H₂O) pour former, avec l'aide de l'anhydrase carbonique, du bicarbonate (HCO₃^-) et un proton (H⁺), ce qui acidifie le sang (Identification of the Carbonic Anhydrase II Binding Site in the Cl-/HCO3- Anion Exchanger AE1 2000).

La baisse d'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène en présence de CO₂ et de pH acide est appelée effet Bohr.

2. L'oxyhémoglobine, à forme R ou relâchée, a exactement les caractéristiques inverses, i.e. forte affinité pour l'oxygène (O₂), ce qui favorise la fixation de l'oxygène lorsque le sang circule au niveau des alvéoles pulmonaires.

Lors de la liaison à O₂, la cavité centrale est liée au 2,3-BPG, i.e. son volume diminue fortement, ce qui explique le manque d'affinité de l'oxyhémoglobine pour Band 3.

Conséquences de l'interaction

1. 21 résidus de cette région 1-23 de Band 3 contiennent des sites de liaison pour des enzymes glycolytiques telles que l'aldolase (ou fructose-bisphosphate aldolase), la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH ou G3PD) et la phosphofructokinase (PFK) qui entrent, comme leurs noms l'indiquent, dans la glycolyse, ou voie d'Embden-Meyerhof-Parnas, voie métabolique d'assimilation du glucose et de production d'énergie et de pyruvate.

• 

  Lorsque ces enzymes sont liées à la bande 3, elles sont partiellement inhibées, mais lorsqu'elles sont libres, elles sont actives (Fluorescence Assay of the Interaction between Hemoglobin and the Cytoplasmic Domain of Erythrocyte Membrane Band3 2016).
• La consommation de glucose érythrocytaire se produit principalement par l'intermédiaire de la glycolyse dans les cellules désoxygénées.
• Lors de l'exposition à O₂, une très grande partie du glucose cellulaire est métabolisée par la voie des pentoses phosphates ou voie de Warburg-Dickens-Horecker qui produit essentiellement, pour notre sujet, du NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, réducteur) et un proton (H⁺).

Ce changement est expliqué par un besoin accru de réducteurs pendant les périodes d'exposition élevée à l'oxygène pour protéger la cellule contre le stress oxydatif (Interaction of deoxyhemoglobin with the cytoplasmic domain of murine erythrocyte band 3 2012).

• Ainsi, en activant la voie du pentose phosphate lors de l'oxygénation des érythrocytes, la cellule est assurée d'une quantité suffisante de NADPH pour la réduction du glutathion, puissant antioxydant, et le maintien de l'hémoglobine en oxyhémoglobine.
• Ces enzymes glycolytiques sont en compétition directe avec le désoxyHb pour l'extrémité NH2 de la bande 3, les enzymes sont déplacées durant la désoxygénation des érythrocytes.

2. Ce mécanisme peut aussi expliquer pourquoi l'état d'oxygénation des globules rouges peut moduler les propriétés mécaniques de la membrane (déformabilité des érythrocytes).

Pendant leur vie de 120 jours, les globules rouges sont pressurés à travers les capillaires ou les sinusoïdes qui mesurent moins de la moitié de leur diamètre.

• Les 2 boucles de liaison à l'ankyrine sur cdb3 sont situées à moins de 15 Å du site de liaison de désoxyHb.
• L'ankyrine devant être sphérique (100 Å environ) comme la désoxyHb (55 Å environ), il paraît plus que probable que la désoxyHb liée à la Band 3 déplace l'ankyrine.

Les périodes de désoxygénation conduiraient donc à la rupture des ponts entre cytosquelette et membrane, provoquant une déformabilité accrue des globules rouges désoxygénés pour qu'ils atteignent plus rapidement les poumons.

Mécanisme alternatif et fonctions de Band 3