Enzymes
Groupe des hydrolases (EC 3)
ATPases : P-ATPases

Ces pompes, parfois ATPases E1-E2 se trouvent chez les procaryotes, les archées et les eucaryotes.

Les P-ATPases (TC# 3.A.3.8) se distinguent des autres transporteurs dépendants de l'ATP, i.e. les ATPases à moteur rotatifs, F-ATPases, V-ATPases, et les transporteurs ABC, par la présence d'un aspartate conservé qui subit une phosphorylation transitoire au cours du cycle ATP.

Les membres de cette famille génèrent et maintiennent des gradients électro-chimiques cruciaux à travers les membranes cellulaires, en transloquant les cations, les métaux lourds et les lipides.

Classification des P-ATPases

Les ATPases de type P, qui comprend plus de 20 familles différentes, forment cinq classes (Evolution of P-type ATPases 1998).

La classification est détaillée dans P-type ATPase de wikipedia

1. Les P1-ATPases

• Les P1A-ATPases ne se trouvent que dans certaines bactéries et transportent le K⁺.
• Les P1B-ATPases transportent des ions de métaux lourds tels que Ag⁺, Zn⁺⁺, Cd⁺⁺ et Cu⁺⁺.

2. Les P2-ATPases

• Les P2A-ATPases comme SERCA (Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca⁺⁺-ATPase) du réticulum endoplasmique (RE) et SPCA (Secretory Pathway Ca⁺⁺-ATPase) de l'appareil de Golgi transportent Ca⁺⁺ et Mn⁺⁺.
• Les P2B-ATPases comme PMCA (Plasma Membrane Ca⁺⁺-ATPase) transportent aussi Ca⁺⁺ et Mn⁺⁺.
• Les P2C-ATPases transportent des ions monovalents et comprennent les Na⁺/K⁺-ATPases et les H⁺/K⁺-ATPases.

La pompe sodium-potassium (Na⁺/K⁺-ATPase) des animaux et la H⁺/K⁺-ATPases des plantes et les champignons maintiennent le potentiel de la membrane plasmique dans toutes les cellules eucaryotes, qui est basé sur différentes concentrations d'ions sur l'intra - et les côtés extracellulaires de la membrane.

• Les P2D-ATPases se trouvent dans les champignons et transportent Na⁺.

3. Les P3-ATPases

• Les P3A-ATPases transportent H⁺.
• Les P3B-ATPases transportent Mg⁺⁺.

4. Les P4-ATPases sont uniques en ce sens qu'elles sont les seules à transporter des lipides, i.e. des phospholipides, substrat dix fois plus gros que les ions, à travers les membranes.

5. Les P5-ATPases jouent un rôle important dans le système endo-lysosomal (The Yeast P5 Type ATPase, Spf1, Regulates Manganese Transport into the Endoplasmic Reticulum 2013).

a. Des études récentes montrent :

• qu'elles exportent des polyamides (ATP13A2 deficiency disrupts lysosomal polyamine export 2020),
• agissent comme des dislocases d'hélices transmembranaires (The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase 2020).

b. Le mécanisme serait le suivant.

• Pendant la transition E1P-à-E2P, le domaine N tourne et le domaine A se rapproche de l'interface N-P, provoquant la conversion de la poche de liaison au substrat ouverte vers l'intérieur du domaine transmembranaire à la conformation ouverte vers l'extérieur.
• Dans ce modèle, une hélice TM de substrat avec un segment luminal court et préférentiellement chargé positivement se lierait à la poche ouverte vers l'extérieur et la transition E2P à E1 ferait basculer la TM par un interrupteur de l'ouverture vers l'extérieur vers l'intérieur.

c. Les P5-ATPases ont été impliquées dans la maladie de Parkinson (Parkinson’s disease-associated human P5B -ATPase ATP13A2 increases spermidine uptake 2013).

Structure des P-ATPases

Les P-ATPases ont la spécificité de contenir des motifs conservés dans les domaines cytoplasmiques.

Sous-unité α

La structure générale d'une sous-unité α de P-ATPase comprend plusieurs domaines.

Domaines transmembranaires

1. Le domaine transmembranaire (M) possède généralement un noyau central à 10 hélices α (M1-M10), i.e. M1-M6 étant à toutes les P-ATPases.

a. Les hélices M7-M10 fonctionnent principalement comme une ancre membranaire pour assurer la stabilité du domaine M (Electrostatic interactions between single arginine and phospholipids modulate physiological properties of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2022).

• 

  Elles peuvent également contribuer à la spécificité du substrat en variant d'une protéine à l'autre.
• Dans certaines P-ATPases, les M7-M10 assumant le rôle d'ancrage sont remplacées par des hélices TM N-terminales (Crystal structure of a copper-transporting PIB-type ATPase 2011) ou complétées par des hélices supplémentaires (P-type ATPases at a glance 2011).

b. deux particularités dans les hélices TM contribuent à la formation d'une poche de liaison intégrée à la membrane pour les cations du substrat.

c. On peut séparer le domaine M en :

• sous-domaine N-terminal, i.e. NTM (formé par M1-M4a),
• sous-domaines C-terminal, i.e. CTM (M4b-M10).

En effet, le site de liaison au substrat est situé entre NTM et CTM, bien qu'il soit davantage associé à CTM. Les changements conformationnels à l'interface NTM/CTM au cours du cycle E1-E2 permettent un accès alterné de ce site de liaison au cytosol ou à l'espace extracellulaire/luminal.

Domaines cytoplasmiques

Les domaines cytoplasmiques comprennent trois domaines.

1. un domaine actuator (A), actionneur en français, i.e. qui transforme l’énergie qui lui est fournie en un phénomène physique.

Le domaine A cytosolique représente une insertion dans le NTM, connecté aux hélices M2 et M3 (dans certains sous-types également à M1) via des liens flexibles, qui limitent la distance maximale entre les domaines A et M.

2. Le domaine de phosphorylation (P) forme une insertion dans le CTM.

• M4b et M5 du CTM s'étendent dans le cytosol et constituent une partie du domaine P.
• Le CTM et le domaine P semblent se déplacer ensemble comme un corps semi-rigide.

3. Le domaine de liaison aux nucléotides (N), domaine N cytosolique, comprend une insertion dans le domaine P à travers une charnière fortement conservée de deux brins peptidiques antiparallèles, pointant ainsi à l'opposé de la membrane

Sous-unités β et γ

La sous-unité α peut être associée à des sous-unités supplémentaires :

• sous-unités β et γ dans la classe P2C (Crystal structure of the sodium –potassium pump at 2.4 A ̊ resolution 2009 et The Structure and Function of the Na,K-ATPase Isoforms in Health and Disease 2017),
• sous-unité β pour la classe P4 ( structure des P4-ATpases ou flippases).

Extensions N- et C-terminales

1. Les H+-ATPases de type P3A possèdent des extensions aux extrémités N- et C-terminales (Structural and Functional Diversity of Two ATP-Driven Plant Proton Pumps 2023).

• 

  L'extension N-terminale peut fonctionner comme un capteur de pH,
• L'extension de la partie C-terminale ou domaine régulateur (R) est auto-inhibitrice et peut être libérée par phosphorylation ou lors de la liaison à des facteurs de régulation.

2. Le domaine régulateur est aussi présent dans les P4-ATPases ou flippases.

Mécanisme des P-ATPases

Vue d'ensemble

1. Les ATPases de type P fonctionnent selon un modèle « à accès alterné » ( transporteurs actifs).

• Dans ce modèle, les voies d'accès aux deux côtés de la membrane sont transitoirement fermées pour enfermer les ions avant de s'ouvrir de chaque côté de manière alternée.
• La translocation ionique réelle est accomplie par des changements conformationnels importants provoqués par l'hydrolyse de l'ATP.

L'ATPase alterne généralement entre deux régimes conformationnels, les états dits E1 et E2.

• Les états E1 sont associés à l'autophosphorylation par l'ATP et ont une forte affinité pour le cation qui doit être expulsé du cytoplasme.
• Les états E2 sont associés à l'autodéphosphorylation, ont une plus faible affinité pour ces cations et peuvent se lier à des contre-ions à la place.

2. Conceptuellement, les phosphorylations/déphosphorylations ressemblent aux événements de protonation et de déprotonation dans les transporteurs secondaires entraînés par la force motrice du proton ou PMF (Thermodynamic secrets of multidrug resistance: A new take on transport mechanisms of secondary active antiporters 2018).

En d'autres termes, la P-ATPase continuerait à parcourir le chemin de E1 → E1P → E2P → E2 → E1 indépendamment du fait que la liaison au substrat se soit produite, tant que l'hydrolyse de l'ATP peut être découplée du transport du substrat.

Mécanisme

Les interactions entre les trois domaines cytosoliques changent en réponse au chargement et à la libération du substrat.

1. Le résidu aspartate clef dans un motif DKTGT conservé du domaine P (par exemple, Asp351 dans SERCA1) alterne entre les états phosphorylé et déphosphorylé.

a. Le domaine N fonctionne comme une kinase intégrée (enzyme-1 ou E1) pour transférer le groupe γ-phosphate de l'ATP au domaine P.

Cette réaction est catalysée en utilisant un mécanisme SN2 médié par deux cofacteurs Mg⁺⁺ liés au domaine P (site I, stabilisant le γ-phosphate ainsi que le résidu clef Asp) et au domaine N (site II, liaison avec le α- et β-phosphates d'ATP ou d'ADP) .

b. en utilisant son motif TGES conservé, le domaine A fonctionne comme une cis-phosphatase pour catalyser la déphosphorylation. Cette dernière réaction utilise également un mécanisme SN2 mais est facilitée par un seul cofacteurMg⁺⁺ lié au site I (How processing of aspartylphosphate is coupled to lumenal gating of the ion pathway in the calcium pump 2007).

Comme les modules kinase et phosphatase ciblent le même résidu Asp dans le domaine P, les domaines N et A doivent commuter activement avec le domaine P, pour se concerter sur le prochain événement déclencheur , i.e. chargement ou libération du substrat pour soutenir les cycles d'hydrolyse de l'ATP.

2. Dans un certain nombre de structures P-ATPase, une hélice amphipathique est observée.

a. À l'extrémité N-terminale de M1, elles sont susceptibles d'ancrer le sous-domaine NTM à la bicouche lipidique, limitant particulièrement le mouvement de l'extrémité N-terminale de M1 à la surface du feuillet cytosolique (Crystal structure of the high-affinity Na+,K+-ATPase– ouabain complex with Mg 2+ bound in the cation binding site 2013),

b. À l'extrémité luminale de M9 ou M10 dans les P4-ATPases, on les trouve aussi dans plusieurs grandes familles de protéines membranaires :comme

• les transporteurs ABC (Thermodynamic secrets of multidrug resistance: A new take on transport mechanisms of secondary active antiporters 2018),
• les récepteurs couplés aux protéines G ou GPCR (Proton transfer-mediated GPCR activation 2014),
• les canaux ioniques voltage-dépendants (Thermodynamics of voltage-gated ion channels 2018).

Ces hélices amphipathiques sont susceptibles de jouer un rôle important en limitant le mode de changements conformationnels de leurs extrémités d'hélice TM connectées au glissement uniquement sur la surface de la membrane (Interplay between the electrostatic membrane potential and conformational changes in membrane proteins 2019).

En outre, les interactions protéine-phospholipide sont régies aussi par des tryptophanes ainsi que par des résidus basiques qui exercent leur effet stabilisateur sur les protéines membranaires par le biais d'interactions entre les dipôles électriques intrinsèques (et induits) de leurs chaînes latérales indole et le fort champ électrique local des phosphates du groupe de tête des molécules lipidiques environnantes.

3. Dans un cycle fonctionnel de la P-ATPase, la liaison et la libération du substrat sont considérées comme des conditions nécessaires pour les événements de phosphorylation et de déphosphorylation, respectivement.

Cependant, les deux types d'événements se produisent à 45 Å de distance l'un de l'autre Ainsi, une question centrale dans le domaine de recherche sur la P-ATPase concerne le(s) mécanisme(s) de communication entre les sites de liaison au substrat et de phosphorylation (Conformational transitions and alternating-access mechanism in the sarcoplasmic reticulum calcium pump 2017 et Thermodynamics of voltage-gated ion channels 2018).

Les études de biologie structurale ont fourni des informations essentielles pour répondre à cette question. Par exemple, SERCA1 contient deux sites de liaison Ca⁺⁺ (Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution 2000).

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