Constituants cellulaires : protéasome 26S
Fonctionnement : translocation du substrat

Une fois l'acceptation du substrat et son engagement effectué, le protéasome déplace la chaîne polypeptidique du substrat vers la chambre catalytique.

• Le déplacement de la base (OB et ATPase), qui suit le déplacement du " couvercle " (lid) par la liaison avec la chaîne polyubiquitinée du substrat, se poursuit par un pivotement de telle sorte que tous les anneaux deviennent alignés de façon coaxiale pour former un canal continu.
• Les boucles des rpt (pore loops) s'accrochent au substrat et le déplace dans la chambre catalytique pour y être dégradé (cf. activité protéolytique).

Le fonctionnement détaillé du protéasome qui suit est tiré en grande partie de l'article Deep classification of a large cryo-EM dataset defines the conformational landscape of the 26S proteasome 2014, mais aussi de nombreux autres.

Vous pouvez aussi voir deux films tirés de cet article : sur les changements de conformation vus de côté et vus du haut du protéasome.

Translocation simplifiée du substrat

Anneau N

L'anneau OB ou N, structure rigide, est en forme d'entonnoir avec un anneau central comportant un anneau proximal (13 Å) bien plus étroit que l'anneau distal.

Le dépliage du substrat est probablement le résultat d'une translocation forcée à travers cet anneau.

Anneau ATPase

Les grands domaines des domaines AAA+ contiennent deux boucles essentielles aux fonctionnement du protéasome (pore loop).

• La boucle Ar-Φ (Aromatic-aliphatic ou pore-1 loop) - Y/F-I/L/V-G -, leur permet de se lier à la protéine, de la déplier et de la transloquer au CP : ces boucles font saillies dans le pore axial de l'anneau AAA+
• La pore-2 loop, situé à côté de la boucle Ar-Φ, semble aussi jouer impliquer dans ces processus. Il semble qu'elle entre aussi en interaction avec le coeur catalytique.

Ces boucles s'accrochent au substrat et le font avancer comme les pales d'un moteur grâce à l'action ATPasique des Rpt dans la chambre catalytique pour leur dégradation (cf. activité protéolytique du protéasome).

Translocation détaillée du substrat

Positionnement de
l'anneau ATPase

Sous-unités mis en jeu

L'anneau ATPase se positionne parallèlement au sommet de l'anneau α du coeur catalytique : translaté (≅6Ã…), en rotation latérale (≅8°), et moins incliné (≅-3°), ce qui aligne ces deux anneaux.

1. Les extrémités C-terminales de Rpt2, Rpt3 et Rpt5, qui contiennent le motif HbYX, restent ancrés dans leurs poches de liaison respectifs de l'anneau α, entre, respectivement, les sous-unités α3/α4, α1/α2, et α5/α6 (Molecular architecture of the 26S proteasome holocomplex determined by an integrative approach 2011 et Reconstitution of the 26S proteasome reveals functional asymmetries in its AAA+ unfoldase 2013).

Ces interactions semblent statiques et indépendantes des nucléotides liés à ces Rpt.

• Dans le motif HbYX, c'est la tyrosine (Y) qui est essentielle pour former des interactions avec les poches.
• Ce motif prend contact avec des résidus conservés - Lys66, mais aussi Gly34 et Leu81 pour PAN - (Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases 2008).

• 

  Il semblerait que l'interaction avec Rpt2 et 5 soit prépondérante pour l'ouverture du canal, alors que celle de Rpt3 est essentielle pour l'assemblage, mais pas pour l'activation (The C Terminus of Rpt3, an ATPase Subunit of PA700 (19 S) Regulatory Complex, Is Essential for 26 S Proteasome Assembly but Not for Activation 2010).
• Une liaison simultanée de Rpt2 et 5 ont un effet synergique sur l'hydrolyse, ce qui suggère qu'ils se lient à des sites distincts sur le protéasome.

Par contre, il semblerait que seul le peptide activé de Rpt5 hydrolyse des substrats protéiques (Proteasomal AAA-ATPases: Structure and function 2012). Pour un autre auteur, c'est l'hydrolyse de l'ATP dans Rpt1 qui serait essentiel pour coordonner la translocation (Reconfiguration of the proteasome during chaperone-mediated assembly 2013).

2. Quant aux Rpt1, 4 et 6, elles ne possèdent pas ce motif.

• Elles sont facultatives pour la liaison base-coeur catalytique, bien que les contacts soient superficiels.
• Rpt1 et 4 n'ont aucune action sur l'ouverture du pore central.

Rpt6 semble lui assurer la bonne position de l'anneau ATPase au sommet de l'anneau α (Reconfiguration of the proteasome during chaperone-mediated assembly 2013).

• Il pourrait jouer un rôle dans la liaison base/coeur.
• En effet, c'est le seul qui montre une nette spécificité pour une poche particulière (α2/α3) par rapport aux autres Rpt, et serait aussi le point de départ de l'assemblage par les protéines chaperonnes, ce qui éviterait par exemple, aux autres de se fixer à un mauvais endroit.

Conséquences

Cette liaison provoque une rotation des sous-unités et l'ouverture du pore.

1. Pour ce qui est du complexe 11S de la levure (PAN, Proteasome-Activating Nucleotidase), qui, contrairement à RP 19S, ne reconnaît pas l'ubiquitine, c'est le mouvement radial et latéral des boucles contenant Pro17 (reverse turn loop) par les boucles activatrices des extrémités C-terminales de PA26, qui les éloignent de l'entrée du pore (Structural Models for Interactions between the 20S Proteasome and Its PAN/19S Activators 2009 et The pore of activated 20S proteasomes has an ordered 7-fold symmetric conformation 2003).

• Cela se traduit par la formation d'un complexe de quatre résidus hautement conservés, Tyr8, Asp9, Pro17 et Tyr26, entre chacune des sous-unités adjacentes (A gated channel into proteasome core particle 2000).
• Ce processus est nécessaire à la stabilisation du complexe et à l'ouverture du pore de la chambre catalytique du coeur (Interactions of PAN's C-termini with archaeal 20S proteasome and implications for the eukaryotic proteasome–ATPase interactions 2009 et Recognition and Processing of Ubiquitin-Protein Conjugates by the Proteasome 2009).

2. Chez les eucaryotes, le mouvement de basculement des sous-unités α ne nécessite pas forcément la boucle d'activation, ni l'interaction avec Pro17, mais utilise plutôt les interactions de leur résidu C-terminal.

• Les peptides induisent une rotation des sous-unités a différentes d'environ 4° et la reverse-turn loop des sous-unités α est déplacé de telle sorte que le pore reste ouvert (Docking of the Proteasomal ATPases’ C-termini in the 20S Proteasomes alpha Ring Opens the Gate for Substrate Entry 2007 et Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases 2008).
• Les différences observées dans les Rpt de l'anneau ATPase, et leurs interactions de leur extrémités C-terminales dans les poches entre les sous-unités α pourraient expliquer leur rôle spécifique (An asymmetric interface between the regulatory particle and core particle of the proteasome 2011).

Chez les bactéries, cela se passe un peu différemment suivant trois formations distinctes (Structural basis for the assembly and gate closure mechanisms of the Mycobacterium tuberculosis 20S proteasome 2010).

Relations avec le cycle ATPasique

La liaison du nucléotide modifie la rotation entre les grands et les petits domaines AAA+ des Rpt, et expliquent le mécanisme permettant de relier le cycle ATPasique aux changements conformationnels dans l'anneau hexamérique des Rpt, à l'alignement des anneaux et, enfin à la translocation du substrat.

La force développée est de 20 à 40 pN (ClpX(P) Generates Mechanical Force to Unfold and Translocate Its Protein Substrates 2011).

Si potentiellement, 6 sites peuvent être utilisés pour la liaison de l'ATP, en règle générale, 4 sont pourvus, mais un seul permet le dépliage et la translocation de la protéine pour sa dégradation, ce qui expliquera l'asymétrie de l'anneau (Crystal structures of asymmetric ClpX hexamers reveal nucleotide-dependent motions in a AAA+ protein-unfolding machine 2009).

En outre, les réarrangements conformationnels de l'anneau ne semblent pas non plus être indispensables. Dans ClpX, l'anneau peut rester fermé sans que cela affecte beaucoup la dégradation de la protéine.

Ces changements d'orientation de la spirale ont été aussi observés dans des hélicases - DnaB ou l'AAA+ hélicase E1 - (The Non-planar Structure of DnaB Hexamer with Its Substrates Suggests A Different Mechanism of Translocation 2012) :

• Il semble que ce stade corresponde au stade où un substrat s'engage dans le pore central, stade long (" dwell "), environ 90% du temps, au cours duquel l'ADP est relarguée et les Rpt rechargés en ATP.
• Le reste (10% du temps) est une phase de bouffée (" burst "), au cours de laquelle le substrat avance d'une certaine longueur à travers le pore, grâce aux pore-loop : cette progression est la conséquence des changements conformationnels coordonnés des sous-unités autour de l'anneau par l'hydrolyse rapide et progressive des différentes Rpt (High Degree of Coordination and Division of Labor among Subunits in a Homomeric Ring ATPase 2012).
• Puis le cycle recommence jusqu'à la translocation complexe du substrat.

De nombreuses communications ont lieu sur ce sujet : ATP binding to neighbouring subunits and intersubunit allosteric coupling underlie proteasomal ATPase function 2015.

Quoi qu'il en soit, il semble que les sous-unités ATPases agissent de manière coordonnée pour hydrolyser l'ATP et ainsi propulser des substrats à travers le canal de translocation.

Positionnement de l'anneau OB

L'anneau OB ou N est plus translaté de 17,5Å que l'anneau ATPase : Rpn1 se déplace de manière identique.

Les autres modifications sont minimes.

Ces processus permettent la translocation du substrat, sa désubiquitination et le recyclage de l'ubiquitine, et sa protéolyse par le coeur catalytique en oligopeptides de 7 à 8 résidus.

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