Constituants cellulaires : protéasome 26S
Base du complexe régulateur 19S : les Rpt

La base, en contact avec le coeur catalytique 20S (CP : Core Particle) comprend (Base-CP proteasome can serve as a platform for stepwise lid formation 2015) :

• 

  6 Rpt : 1 à 6 (Regulatory particle triple-A protein ou Regulatory particle triphosphatase)
• 4 Rpn : 1, 2, 10, 13 (Regulatory particle non-ATPase).

Le protéasome est une structure dynamique qui modifie sa conformation durant le processus et qui interagit avec un grand nombre de protéines.

• La description ci-dessous concerne surtout la nomenclature, la structure, la conformation des différentes protéines : les positions décrites sont celles supposées du protéasome libre de tout substrat.
• Les changements conformationnels ou positionnels sont décrits dans le fonctionnement du protéasome.

L'assemblage du complexe régulateur est favorisé par des protéines chaperons et s'effectue indépendamment pour la base et le " couvercle ".

Rpt1-6

6 des 10 protéines, appelées Rpt1 à 6 (Regulatory particle triple-A protein ou Regulatory particle triphosphatase) forment un complexe héxamérique à activité ATPasique qui est directement en contact avec l'anneau α.

• Elles font partie des AAA-ATPases - ATPases Associated with various cellular Activities -, ou AAA+,
• Cet anneau est rattaché au complexe PAN - Proteasome-Activating Nucleotidase - (Structural Insights Into The Regulatory Particle Of The Proteasome From Methanocaldococcus jannaschii 2009 et Mechanism of Substrate Unfolding and Translocation by the Regulatory Particle of the Proteasome from Methanocaldococcus jannaschii 2009).

Structure des Rpt

Leurs structure est composée de deux domaines.

Domaine N-terminal

Le domaine N-terminal, est constitué par :

• un domaine OB - (Oligonucleotide ou Oligosaccharide ou Oligomer Binding - (74-89 dans PAN),

• 

  une hélice N-terminale (90-150 dans PAN).

Anneau OB

Les 6 domaines forment un anneau (anneau N ou OB), séparé de celui des ATPases, formé de 3 dimères : Rpt3/6, Rpt4/5 et Rpt1/2.

Cet anneau N est en forme d'entonnoir avec un anneau central comportant (Mechanism of Substrate Unfolding and Translocation by the Regulatory Particle of the Proteasome from Methanocaldococcus jannaschii 2009) :

• un anneau distal formé par la boucle L45 (Asn138-Gln139-Gln140-Thr141)
• un anneau proximal, près de l'anneau ATPase, par la boucle L23 (Ser111-Thr-112-Gly113)
• une surface intérieure hydrophobe entre les deux anneaux (Pro91, Ile93, Pro114, Pro116, Leu137 et Leu142).

Cette structure étant rigide et l'anneau proximal (13Å) étant bien plus étroit que l'anneau distal, le dépliage du substrat est probablement le résultat d'une translocation forcée à travers cet anneau.

• Gly113, situé à la pointe de l'anneau proximal (L23), ne possède pas de chaîne latérale et permet une grande flexibilité de la chaîne principale. Sa substitution provoque une perte du dépliage et de la dégradation du substrat. Les substitutions sur l'anneau distal ont beaucoup moins d'effet.

• 

  La surface hydrophobe joue aussi un rôle dans la facilitation de dépliage et la translocation du substrat : la substitution de Pro114 diminue fortement (70 à 80%) ce processus.

L'anneau N est faiblement connecté à l'anneau ATPase par une séquence flexible de 8 résidus - 150-158 - (cf. structure primaire) et l'axe et leur pore central ne coïncide pas.

• Asp153 est présent chez PAN et les Rpt. Ala156 de PAN est remplacée par un acide aminé hydrophobe dans toutes les sous-unités Rpt. Ces caractéristiques sont susceptibles d'être fonctionnellement pertinentes.
• Des substitutions sur ces résidus inhibent totalement le dépliage du substrat et diminue drastiquement sa dégradation, montrant bien que les deux anneaux (N et ATPase) coopèrent.

Le couplage entre les subcomplexes I et II implique des interactions transitoires par six acides aminés à la surface distale du subcomplexe II : Ser250, Leu251, Lys253, Asp254, Glu261 et Lys262 situés sur l'hélice α5 et sont conservés dans les sous-unités Rpt et doivent aussi jouer un rôle.

Superhélices (coiled coil) des Rpt (Rpt3/6, Rpt4/5, et Rpt1/2)

Les deux hélices N-terminales de chaque dimère (1/2, 3/6 et 4/5) forment trois domaines coiled-coil (superhélices) qui font protrusion et forment une sorte de tripode.

• 

  La superhélice de Rpt6/3 contacte Rpn2 et interagit avec le paquet de superhélices formé par les extrémités C-terminales des sous-unités du " couvercle ". Ces liaisons restreignent sa liberté de mouvement : elle ne peut se déplacer que comme un ' bras oscillant ' (Molecular architecture of the 26S proteasome holocomplex determined by an integrative approach 2012).
• La superhélice de Rpt1/2 (27 résidus) semble interagir, car sa résolution est plus difficile, avec Rpn1 de la même façon que Rpt6/3 avec Rpn2.
• La superhélice Rpt4/5 (33 résidus) n'entre pas en interaction avec les non-ATPases, mais elle semble montrer une grande flexibilité, ce qui fait que sa résolution est elle aussi difficile.

Les superhélices, par contre, contiennent un certain nombre de résidus polaires et chargés (R81/82/86/88, E83, V89, P9 chez PAN - voir les correspondances avec les Rpt dans l'article -), qui pointent à l'intérieur de l'entonnoir.

• Étonnement, leurs substitutions par l'alanine, provoquent un accroissement du dépliage et de la dégradation du substrat, peut-être en diminuant leur action sur des résidus chargés négativement du substrat qui ralentissent le processus.
• Ces superhélices sont liées au domaine OB par une séquence de trois résidus (XPP) dans tous les domaines OB, excepté Rpt1 qui en contient 4. Dans les Rpt, si la première proline est absente, la deuxième est invariante - cf. structure primaire - (Structure and Activity of the N-Terminal Substrate Recognition Domains in Proteasomal ATPases 2009).

Domaine AAA+

Le domaine AAA+ est un domaine canonique (155-430 dans PAN) avant l'extrémité C-terminale (Proteasomal AAA-ATPases: Structure and function 2012).

• Ce domaine est formé d'un grand sous-domaine α/β (G sur la figure) et d'un petit sous-domaine α (P sur la figure) C-terminal.
• Le site de liaison de l'ATP étant situé dans une fente entre les deux.

Anneau ATPase et corps rigides

Dans le complexe héxamérique, le site de liaison de l'ATP se retrouve dans l'anneau ATPase entre le petit domaine d'une unité et ie grand domaine de l'unité suivante pour former un corps rigide comme dans ClpX (Dynamic and static components power unfolding in topologically closed rings of a AAA+ proteolytic machine 2012).

Cette conformation explique le mécanisme qui permet de relier le cycle de l''ATP aux changements conformationnels dans l'anneau hexamérique et l'engagement et la translocation du substrat.

Boucles du pore (pore loops)

Les grands domaines des domaine AAA+ contiennent deux boucles essentielles aux fonctionnement du protéasome (pore loops) qui forment aussi deux anneaux comme pour les domaines OB.

1. L'anneau distal comprend la boucle Ar-Φ (Aromatic-aliphatic ou pore-1 loop) - Y/F-I/L/V-G -, leur permet de se lier à la protéine, de la déplier et de la transloquer au coeur catalytique.

• Ces boucles font saillies dans le pore axial de l'anneau AAA+ (Diverse pore loops of the AAA+ ClpX machine mediate unassisted and adaptor-dependent recognition of ssrA-tagged substrates 2009 et Functional Asymmetries of Proteasome Translocase Pore 2012).
• Cette boucle est composée de Phe244-Ile245-Gly246 chez PAN (voir les correspondances avec les Rpt dans l'article).
• Les substitutions de ces résidus inhibent le dépliage et la translocation des substrats, comme celle de la tyrosine des Rpt (Pore loops of the AAA+ ClpX machine grip substrates to drive translocation and unfolding 2008).

2. Un anneau proximal comprenant la pore-2 loop, situé à côté de la boucle Ar-Φ, semble aussi être impliquée dans ces processus (Reconstitution of the 26S proteasome reveals functional asymmetries in its AAA+ unfoldase 2013).

• Cette boucle est formée par Thr284-Gly285-Gly286 chez PAN (voir les correspondances avec les Rpt dans l'article).
• Il semble qu'elle entre aussi en interaction avec le coeur catalytique (Bipartite determinants mediate an evolutionarily conserved interaction between Cdc48 and the 20S peptidase 2013).

Ces boucles se lient au substrat et le font avancer comme les pales d'un moteur, grâce à l'action ATPasique des Rpt, dans la chambre catalytique pour leur dégradation (cf. translocation du substrat)

Extrémités C-terminales

Les extrémités C-terminales des Rpt permettent la fixation de la base à l'anneau α et lui permettent de suivre les modifications conformationnelles des Rpt dans les différentes phases du fonctionnement du protéasome.

Les Rpt forment une spirale qui se modifie lors de ce fonctionnement (modification de la spirale).

1. Les extrémités C-terminales des Rpt2, 3 et 5 possèdent un motif HbY(Tyr)X, dans lequel X est le résidu C-terminal et Hb un résidu hydrophobe.

Elles prennent contact, dans des poches situées entre les sous-unités α, avec des résidus conservés - Lys66, mais aussi Gly34 et Leu81 pour PAN - (Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases 2008).

• Les extrémités C-terminales de Rpt2, Rpt3 et Rpt5 entre, respectivement, les sous-unités α3/α4, α1/α2, et α5/α6 (Molecular architecture of the 26S proteasome holocomplex determined by an integrative approach 2011 et Reconstitution of the 26S proteasome reveals functional asymmetries in its AAA+ unfoldase 2013).

2. Quant aux Rpt1, 4 et 6, elles ne possèdent pas ce motif.

• Elles sont facultatives pour la liaison base-coeur catalytique.

• 

  Rpt1 et 4 n'ont aucune action sur l'ouverture du pore.

Canal central

Ces deux domaines forment des anneaux (N ou OB pour les domaines OB et ATPase ou AAA+ pour les domaines AAA+) avec un canal central.

• Cependant, dans un protéasome sans substrat, on ne voit pas de canal continu pour amener le substrat à la chambre catalytique : les canaux centraux des anneaux OB, AAA+ du 19S de l'anneau α du coeur catalytique 20S ne sont pas alignés, et en plus le pore d'entrée des antichambres est occlus.
• Toutefois, lors de la liaison au substrat, les anneaux sont alignés par l'élargissement important de l'anneau AAA+ (cf. engagement du substrat) . En outre, les cycles ATPasiques provoquent des changements conformationnels des corps rigides (Rigid Bodies) de l'anneau AAA + : ces mouvements sont transmis au substrat, au moins en partie, par des boucles Ar-Φ et la pore-2 loop pour sa translocation.

Rpn1, 2, 10, 13 de la base du complexe régulateur 19S