Trafic vésiculaire : endocytose clathrine dépendante (CME)
Reconnaissance du cargo et adaptateurs à la clathrine : adaptines

L'endocytose la plus étudiée est sans nul doute l'endocytose clathrine-dépendante (CME : clathrin-dependant endocytosis) qui s'effectue en plusieurs étapes pour former la vésicule (Structural Organization of the Actin Cytoskeleton at Sites of Clathrin-Mediated Endocytosis 2011).

• 1. Les molécules " cargo " sont, le plus souvent, reconnues spécifiquement par un récepteur auquel, en général, elles se lient.
• 2. Ce complexe récepteur-cargo se couple ensuite à une protéine nommée adaptateur à la clathrine ( adaptines ou adaptateurs alternatifs), car la cage de clathrine ne peut se lier à la membrane.
• 3a. Un réseau de protéines (coat - " manteau, couche " - protein) à base de clathrine se forme à la face interne de la membrane plasmique pour former les CCS (clathrin-coated structures).

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  3b. L'invagination de la membrane est provoquée par l a formation d'une dépression peu profonde faisaant intervenir des protéines à domaine BAR.
• 4. L'approfondissement de cette dépression et le rétrécissement de son goulot forme une poche profondément invaginée, grâce au recrutement des NPF (Nucleation Promoting Factor), du complexe Arp2/3 et de la polymérisation de l'actine.
• 5. Le détachement de la membrane de la vésicule endocytaire s'effectue grâce, en général, à la dynamine.

Dans ces deux derniers stades, les myosines ont aussi un rôle.

• 6. La vésicule migre vers l'intérieur de la cellule grâce à l'actine et à la myosine.
• 7. La vésicule se déshabille.

L'assemblage est relativement stable alors que le démontage est très rapide : le cycle complet ne dure que 30 à 60 secondes.

• 8. La vésicule pénètre dans les endosomes précoces.

• En effet, le début est encore sujet à contreverse : est-ce la reconnaissance du cargo, la fixation de l'adaptine à la membrane (The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit 2012), la courbure de la membrane par les protéines à domaine BAR (FCHo Proteins Are Nucleators of Clathrin-Mediated Endocytosis 2010) ?
• Pour le début controversé de l'endocytose, lire l'article " From uncertain beginnings : Initiation mechanisms of clathrin-mediated endocytosis 2013 ".

En outre, si le processus de base est utilisé par toutes les cellules, certaines régulations peuvent être spécifiques : la présence des protéines à domaine N-BAR,, domaine F-BAR ou l'epsine qui courbent la membrane peut, par exemple, compenser l'absence de dynamine pour détacher la vésicule de la membrane.

1. Reconnaissance de la cargaison

La reconnaissance de la cargaison protéique (" cargo ") est effectuée par le récepteur adéquat.

Cette reconnaissance est classique lors de l'absorption de la transferrine (Tf : transporteur du fer sérique) et des LDL (Low Density Lipoprotein, transporteur du cholestérol) par l'intermédiaire de leurs récepteurs respectifs (TfR et LDLR) POUR VOIR OÙ ON LE MET ET FAIRE LES LIENS APPROPRIÉS

Il existe plus de 25 récepteurs différents.

• Toutefois, la liaison d’un ligand n’est pas nécessairement requise pour l’internalisation comme dans le cas de celui du récepteur au LDL.

Ce dernier particulièrement étudié (840 acides aminés, dont seulement 50 du côté cytoplasmique) est internalisé, fait le voyage complet pour se retrouver dans la membrane plasmique en 10 minutes, soit plusieurs centaines de voyages dans sa vie qui ne dure que 20 heures.

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  De plus, différents récepteurs peuvent être internalisés dans la même vésicule recouverte de clathrine (jusqu'à 1000).

2. Adaptateurs à la clathrine

Le récepteur recrute un complexe adaptateur ou adaptine pour la clathrine (AP - Adaptor Protein - ou PA en français) dont on connaît une vingtaine de types (pour une revue de ces adaptateurs). On trouve :

• des adaptateurs classiques comme les adaptines hétérotétramèriques,
• des adaptateurs alternatifs monomériques comme les GGA, les epsines ou d'autres.

Le terme " cargo adaptors " désigne les protéines qui lient le cargo dans le puit de clathrine et peut désigner les adptateurs comme les nombreuses protéines accessoires (AAK1, epsine, Eps15, auxilline, β-arrestine, Dab2, synaptojanine, amphiphysine, protéines à domaine BAR, Numb, ubiquitine… - cf tableau -)

La clathrine a besoin de ces adaptateurs car elle ne peut se lier à la membrane (Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane 2011).

Adaptateurs classiques : adaptines (AP)

Ces adaptines reconnaissent le récepteur par une séquence particulière de son domaine cytosolique qui est appelé peptide signal par lequel elles se lient à lui (formation et recrutement de l'AP2).

Ces adaptines sont des hétérotétramères (α, β, μ et σ), légérement différents suivant les AP (numérotées de 1-4) :

• Les mammifères possèdent six adaptines hétérotétramèriques : AP1A, AP2, AP3A et AP4, avec deux isoformes AP5 - AP1B épithélial - et AP6 - AP3B neuronal -.
• Les sous-domaines, suivant les AP, sont numérotés de 1 à 4 pour β, μ et σ, mais sont dénommés γ (1), α (2), δ (3) et ε (4) pour la sous-unité α.

La description suivante correspond à l'AP2, principal adaptateur de la membrane plasmique impliqué dans la formation de cages de clathrine lors de l'endocytose. Sa forme peut être représentée grossièrement par la tête de Mickey.

Les autres AP, peu différentes (Clathrin-associated adaptor protein complexes 2006), sont localisées dans les endosomes et l'appareil de Golgi.

1. Deux grandes sous-unités (α et β2 de 100 kDa) sont formés par :

• un domaine N-terminal qui se lie avec la moyenne (μ2) et la petite sous-unité (σ2) pour former le corps de l'adaptine,
• un domaine moyen ayant un rôle de charnière (hinge),
• un domaine C-terminal, l'appendice ou l''oreille, relié au noyau par l'intermédiaire d'un long segment flexible qui interagit avec la clathrine, diverses adaptines ou des protéines accessoires (cf. figure).

La sous-unité α :

• se lie à la membrane plasmique par le PIP2 [phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate ou PtdIns(4,5)P2] ou au (4)-monophosphate (PtdIns(4)P) du Golgi,
• interagit avec unela petite GTPase Arf (ADP-ribosylation factor).

La sous-unité β2 se lie à :

• la clathrine (domaine C-terminal de la chaîne lourde) par 2 séquences LΦxΦD/E (boîtes à clathrine ou CBM : Clathrin-Binding Motif) chez les mammifères (leucine, Φ - acide aminé hydrophobe - et x - acide aminé polaire - D/E en dernier) qui sont situées une sur sa charnière et une autre sur son oreille,
• la membrane, de manière identique à la sous-unité α.

2. La sous-unité moyenne (μ2 de 47-50 kDa) possède :

• un domaine N-terminal qui contribue au corps de l'adaptine avec α, β2 et σ2,
• un domaine C-terminal qui reconnait le peptide signal du récepteur.

Ce peptide signal est une séquence particulière du domaine cytosolique du récepteur qui se lie au domaine C-terminal de la sous-unité μ, pour l'intégration dans le puit de clathrine et peut différer selon les cas.

• Tyr (Y)XXΦ, où l'acide aminé X polaire est spécifique pour l'adaptine et Φ est un acide aminé hydrophobe. C'est le cas pour les protéines de la membrane plasmique (clathrine/AP2, sous-unité μ1) et du trans-Golgi (clathrine/AP1, sous-unité μ2),
• Asn-Pro-X-Tyr (NPXY) s'applique aux LDL (clathrine/AP2).
• Leu-Leu (LL) intervient pour d'autres protéines de la membrane plasmique (clathrine/AP2).

Toutefois, l'interaction entre les sous-unités C-terminale de μ2 et β2 (conformation fermée) masque le motif YXXΦ de reconnaissance du récepteur et AP2 montre une faible affinité pour le cargo et la membrane.

Le domaine C-terminal de μ2 subit un changement conformationnel lors de la formation de la vésicule (A Large-Scale Conformational Change Couples Membrane Recruitment to Cargo Binding in the AP2 Clathrin Adaptor Complex 2010).

• Après la liaison des sous unités α et β2 à la membrane, les forces électrostatiques forcent μ2 à prendre une conformation ouverte.
• En outre, la thréonine 156 entre les domaines C et N-terminal de la sous-unité μ2 peut être phosphorylée par AAK1 (AP2 associated kinase 1), une sérine/thréonine kinase de la famille Ark1/Prk1 (The Ark1/Prk1 family of protein kinases 2003), qui se fixe sur l'oreille de la sous-unité α, ce qui multiplie par 100 son affinité pour le cargo et la membrane.
• Cette phosphorylation provoque un changement conformationnel de μ2 (rotation de 129° autour de son grand axe et translation de 39 Å - la moitié de sa longueur -, par rapport a son domaine N-terminal) qui expose le motif de liaison YXXΦ.

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    Ce domaine se lie aussi à 2 PIP2 [phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate ou PtdIns(4,5)P2] pour laisser le motif exposé.
  • Cette phosphorylation est très fortement stimulée par la clathrine.

L'auxilline/GAK (protéines homologues : cyclin G–Associated kinase ubiquiste et auxilline purement cérébrale), agit de manière identique à AAK1 et peut aussi intervenir dans ce processus chez les mammifères, bien qu'elle est aussi d'autres rôles :

• déshabillage de vésicules recouverts de clathrine (co-chaperon de Hsc70 - Heat-shock protein -) : son domaine J stimule l'hydrolyse de l'ATP par Hsc70 (Life of a clathrin coat: insights from clathrin and AP structures 2013) ;
• (Recruitment dynamics of GAK and auxilin to clathrin-coated pits during endocytosis 2008)
• trafic des récepteurs comme le récepteur du facteur de croissance épidermique (Multiple Roles for Cyclin G-Associated Kinase in Clathrin-Mediated Sorting Events 2005).

Ce domaine contacterait PI4P qui pourrait être produit à partir de PI(4,5)P2 par une enzyme telle que la synaptojanine ou une lipide phosphatase analogue recrutée par la vésicule (Two synaptojanin 1 isoforms are recruited to clathrin-coated pits at different stages 2006).

3. La petite sous-unité (σ2 de 17-19 kDa) possède un autre motif de liaison au cargo du type dileucine (ED)xxxL(LI) - Asp/Glu-x-x-x-Leu-Leu/Ile - qui est lui aussi exposé par le changement conformationnel de μ2 (The γ/σ1 and α/σ2 Hemicomplexes of Clathrin Adaptors AP-1 and AP-2 Harbor the Dileucine Recognition Site 2007).

AP alternatifs